Конфокальная визуализация и визуализация сверхвысокого разрешения поляризованного внутриклеточного трафика и секреции белков базальной мембраны во время оогенеза дрозофилы
Summary
Базальная мембрана необходима для морфогенеза тканей и органов во время развития. Чтобы лучше понять механизмы, ведущие к правильному размещению этой структуры, представленный протокол описывает методы визуализации и характеристики внутриклеточного трафика и секреции белков базальной мембраны в эпителиальных клетках с использованием конфокальной микроскопии и микроскопии сверхвысокального разрешения.
Abstract
Базальная мембрана (БМ) – специализированный лист внеклеточного матрикса, присутствующий на базальной стороне эпителиальных клеток – имеет решающее значение для установления и поддержания морфологии эпителиальной ткани и морфогенеза органов. Кроме того, БМ необходим для моделирования тканей, выступая в качестве сигнальной платформы и обеспечивая внешние силы для формирования тканей и органов. Несмотря на многие важные роли, которые БМ играет во время нормального развития и патологических состояний, биологические пути, контролирующие внутриклеточный трафик БМ-содержащих везикул и то, как базальная секреция приводит к поляризованному отложению белков БМ, плохо изучены. Фолликулярный эпителий яичника Drosophila является отличной модельной системой для изучения базального осаждения мембранных белков BM, поскольку он производит и секретирует все основные компоненты BM. Конфокальная и сверхвысокая визуализация в сочетании с обработкой изображений в фиксированных тканях позволяет идентифицировать и характеризовать клеточные факторы, специфически участвующие во внутриклеточном трафике и отложении белков BM. В этой статье представлен подробный протокол окрашивания и визуализации BM-содержащих везикул и депонированных BM с использованием эндогенно меченых белков в фолликулярном эпителии яичника Drosophila . Этот протокол может быть применен для решения как качественных, так и количественных вопросов, и он был разработан для обеспечения высокопроизводительного скрининга, позволяющего быстро и эффективно идентифицировать факторы, участвующие в поляризованном внутриклеточном трафике и секреции везикул во время развития эпителиальной ткани.
Introduction
Базальная мембрана (BM) представляет собой тонкий лист слоистого клеточного адгезивного внеклеточного матрикса (ECM), критического для эпителиальной структуры и морфогенеза1. Он содержит ~ 50 белков и находится повсеместно лежащим в основе эпителиальных и эндотелиальных клеток, а также обволакивает скелетные, гладкие и сердечные мышечные клетки и адипоциты 1,2,3. Тремя основными компонентами БМ на базальной стороне эпителиальных клеток являются коллаген IV, перлекан и ламинины. BM лежит в основе эпителиальных клеток и отвечает за многие функции, включая разделение тканей и барьер, рост и поддержку, а также поляризацию клеток 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Его роль в качестве сигнальной платформы регулирует морфологию и дифференцировку эпителиальных клеток и тканей во время развития 3,13,14. Более того, неправильная регуляция БМ и/или нарушение его целостности являются основными причинами многих патологических состояний, включая метастазирование опухоли 2,15,16. Несмотря на существенные функции, выполняемые БМ во время морфогенеза тканей и органов, компоненты биологического пути (путей), предназначенные для поляризованного внутриклеточного трафика и секреции белков БМ, смутно известны.
Для изучения внутриклеточного трафика BM-содержащих везикул и секреции белков BM эпителиальными клетками фолликулярный эпителий (FE) яичника Drosophila является мощной модельной системой (рисунок 1). Яичник дрозофилы содержит 16-20 длинных трубчатых структур, называемых явариолами (рисунок 1A,B)17,18,19. Каждый овариол можно рассматривать как линию сборки яиц с возрастной прогрессией яйцеклеток (каждая из которых дает начало яйцеклетке), которая начинается на переднем конце и движется кзади, пока зрелая яйцеклетка не выйдет через яйцевод. Каждая яйцеклеточная камера инкапсулирована FE, монослоем клеток соматических фолликулов (FC), который окружает клетки центральной зародышевой линии (GC). FE сильно поляризован с отчетливой апикально-базальной полярностью, где апикальный домен обращен к зародышевой линии, а белки BM секретируются базально18,19. ФК активно секретируют все основные компоненты БМ, включая коллаген IV, перлекан и ламины20,21. В эпителиальных клетках, таких как FC, компоненты BM вырабатываются и требуют специализированного поляризованного пути секреции для их внеклеточного осаждения. Например, в случае наиболее распространенного компонента БМ, коллагена IV (Coll IV), детали, окружающие его поляризованный внутриклеточный трафик и секрецию, расплывчаты, несмотря на то, что его производство и осаждение находятся в центре внимания многих исследований. Coll IV транслируется в эндоплазматический ретикулум (ER), где каждая фибриля, состоящая из трех полипептидов (две цепи α1 и одна цепь α2), собирается в тройную спираль22. Правильное складывание и функционирование Coll IV требуют ER-шаперонов и ферментов, включая лизил и пролил-гидроксилазы, такие как Plod и PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Эти посттрансляционные ферменты регулируют сортировку ER Coll IV, так как потеря каждого из них приводит к тому, что Coll IV попадает в ловушку в базальном ER 20,23,24,25,26. Затем вновь синтезированный Coll IV выходит из ER для Гольджи в везикулах, покрытых COPII. Грузовой рецептор Tango1 помогает упаковывать коллагены в значительные везикулы, связанные с Гольджи, которые могут вмещать большие многомерные белки20,27. Как только Coll IV упаковывается во внутриклеточные экзоцитарные везикулы, он специфически секретируется базально из эпителиальных клеток. Чтобы направить отложение БМ на базальную сторону, эпителиальным клеткам требуется другой набор факторов, специально предназначенных для поляризованной секреции БМ. Используя FE яичника Drosophila, были охарактеризованы несколько компонентов этого нового клеточного процесса, включая нуклеотидные обменные факторы (GEFs) Crag and Stratum, GTPasEs Rab8 и Rab10, а также уровни фосфоинозитида PI(4,5)P2 и моторных белков Kinesin 1 и 3 20,28,29,30,31 . Эти компоненты имеют решающее значение для обеспечения поляризованного распределения белков BM.
Для мониторинга внутриклеточной локализации белков BM в FE могутбыть использованы эндогенно меченые белки базальной мембраны (белковые ловушки), такие как Viking-GFP (Vkg-GFP или α2 Coll IV-GFP) и Perlecan-GFP (Pcan-GFP). Было показано, что эти линии белковой ловушки точно отражают эндогенное распределение белков BM и позволяют более чувствительно обнаруживать везикулярный трафик28,30. Компоненты, участвующие в поляризованном осаждении БМ в FE, были впервые охарактеризованы с использованием линий белковых ловушек для Vkg-GFP и Pcan-GFP 20,28,29,30. Белковые ловушки могут быть использованы в различных генетических фонах, включая мутантов и линии Gal4 34. Кроме того, белковые ловушки могут быть использованы в комбинации с флуоресцентными красителями и/или флуоресцентным иммуноокрашиванием, что позволяет точно охарактеризовать локализацию белков BM при сравнении условий дикого типа и мутантов35.
Для точной и эффективной оценки распределения и локализации везикул, содержащих белки BM, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) и методы визуализации со сверхвысоким разрешением представляют собой значительное преимущество перед другими подходами к визуализации. Эти подходы сочетают изображения с высоким разрешением с относительной простотой использования. CLSM – это метод микроскопии, который позволяет улучшить оптическое разрешение путем сканирования образца лазером в растровом сканировании с использованием гальванометров. Отверстие с точечным отверстием является основным компонентом конфокального микроскопа. Блокируя нефокусированные сигналы, поступающие сверху или ниже фокальной плоскости, апертура с точечным отверстием приводит к значительному превосходному разрешению по осиZ 36. Это также позволяет получить серию изображений в z-плоскости, называемую z-стеком, соответствующую ряду оптических сечений. z-стеки впоследствии создают 3D-изображение образца с помощью 3D-реконструкции с помощью программного обеспечения для визуализации. Обычные эпифлуоресцентные (широкоугольные) микроскопы, в отличие от конфокальных микроскопов, позволяют расфокусированному свету способствовать качеству изображения, снижению разрешения изображения и контрастности36,37. Это делает эпифлуоресцентную микроскопию менее привлекательным кандидатом при изучении локализации белка или колокализации.
Хотя CLSM является подходящим подходом для различных применений, включая визуализацию и характеристику внутриклеточного трафика белков BM, он по-прежнему представляет проблему при визуализации образцов ниже дифракционного предела света Аббе (200-250 нм). При визуализации таких образцов конфокальная микроскопия, особенно при использовании масляного объектива, может привести к высокому разрешению. Однако методы сверхвысокого разрешения превышают предел конфокальной микроскопии. Существуют различные подходы к достижению микроскопии со сверхвысоким разрешением, каждый из которых имеет определенные пределы разрешения, и каждый подходит для различных анализов. Эти подходы включают фотоактивированную локализационную микроскопию (PALM) или стохастическую оптическую реконструкционную микроскопию (STORM), микроскопию с стимулированным эмиссионным истощением (STED), структурированную микроскопию освещения (SIM) и микроскопию Airyscan (сверхразрешение) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Хотя Airyscan имеет более грубое разрешение, чем PALM / STORM, STED и SIM, он все же может достигать разрешения до ~ 120 нм (примерно в два раза больше разрешения CLSM). Кроме того, было показано, что этот подход к микроскопии со сверхвысоким разрешением имеет преимущество перед SIM и другими методами сверхвысокого разрешения при визуализации толстых образцов и образцов с низким отношением сигнал/шум47,48.
Airyscan является относительно новой технологией конфокальной микроскопии сверхвысокального разрешения46. В отличие от традиционных CLSM, которые используют точечные и одноточечные детекторы для отклонения нефокусированного света, этот подход со сверхвысоким разрешением использует 32-канальный детектор площади фотоумножителя арсенида галлия (GaAsP), который собирает весь свет в каждой позиции сканирования45. Каждый из 32 детекторов работает как небольшое точечное отверстие, уменьшая размер точечного отверстия с традиционного 1.0 Airy Unit (A.U.) до улучшенного 0.2 A.U., обеспечивая еще более высокое разрешение и отношение сигнал/шум, сохраняя при этом эффективность диаметра 1,25 A.U.45. Кроме того, линейная деконволюция, используемая Airyscan, приводит к увеличению разрешения45 в 2 раза. Принимая это во внимание, CLSM и, в частности, микроскопия со сверхвысоким разрешением хорошо подходят для изучения белков BM и белков, которые регулируют базальное осаждение белков BM, поскольку они могут производить изображения с очень высоким разрешением для исследований локализации и колокализации, тем самым обеспечивая новое понимание пространственных, временных и молекулярных событий, которые контролируют эти процессы.
Альтернативным подходом к конфокальной микроскопии, который может быть использован для проведения экспериментов по локализации, является деконволюция изображений. Поскольку широкоугольная микроскопия позволяет нефокусированному свету достигать детекторов, математические и вычислительные алгоритмы деконволюции могут быть применены для удаления или переназначения нефокусированного света из изображений, полученных с помощью широкоугольной микроскопии, тем самым улучшая разрешение и контрастность изображения49. Алгоритмы деконволюции также могут быть применены к конфокальным изображениям для дальнейшего увеличения разрешения и контрастности, создавая конечные изображения, почти сопоставимые с микроскопией сверхвысокого разрешения50. Airyscan использует деконволюцию на основе фильтра Вайнера вместе с переназначением пикселей Шеппарда, что приводит к значительно улучшенному пространственному разрешению и соотношению сигнал/шум. По сравнению с конфокальной микроскопией, увеличение разрешения в 2 раза во всех трех пространственных измерениях (120 нм в x и y и 350 нм в z) наблюдается при использовании этого метода микроскопии со сверхвысоким разрешением45,51.
Эта рукопись содержит подробные и оптимизированные протоколы для окрашивания, получения и визуализации внутриклеточного трафика и осаждения белков BM с использованием FE яичника Drosophila в качестве модельной системы в сочетании с конфокальной микроскопией и микроскопией сверхвысокального разрешения. Линии дрозофилы , экспрессирующие эндогенно меченые белки базальной мембраны, например, Vkg-GFP и Pcan-GFP, являются эффективными и точными инструментами для визуализации трафика и секреции белка BM. Кроме того, они могут быть легко использованы в различных генетических фонах, включая мутантные и Gal4/UAS линии34. Хотя рекомендуются эндогенно помеченные белки базальной мембраны, использование антител против специфических белков BM также совместимо с описанными протоколами. Эти протоколы особенно полезны для ученых, которые заинтересованы в изучении внутриклеточного трафика и секреции белков BM в интактной эпителиальной ткани с использованием конфокальной визуализации и визуализации сверхвысокого разрешения. Более того, способность сочетать анализ эпителиальной ткани с обширными инструментами генетики дрозофилы делает этот подход особенно мощным. Наконец, эти протоколы могут быть легко адаптированы для изучения везикулярного трафика и сортировки других белков, представляющих интерес.
Protocol
Representative Results
Discussion
БМ имеет решающее значение для эмбрионального и органного морфогенеза, а также физиологических функций взрослых. Кроме того, БМ выступает в качестве сигнальной платформы для установления и поддержания эпителиальной полярности и обеспечивает тканям поддержку2. Тем не мен?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны Джули Меркл за ее полезные комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана грантом NIH R15GM137236 для O.D. Изображения с конфокальным и сверхвысоким разрешением были получены с помощью Zeiss LSM 900 с Airyscan 2, приобретенного с помощью гранта NSF MRI 2018748.
Materials
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 of 66µM) |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 of 66µM)) |
| Anti-GM130 Antibody | abcam | ab30637 | For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mounting Medium |
| Bakers Yeast (Active Dry Yeast) | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten the overies for dissection |
| Bovine Serum Albumin (30% solution) | Sigma-Aldrich | A7284 | For blocking solution |
| Depression wells | Electron Microscopy Sciences | 7156101 | For dissection (glass concavity slide can be used instead) |
| Dissecting needle | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi against Crag |
| Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE | ||
| Forceps (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | For dissection |
| Glass Concavity Slide | Electron Microscopy Sciences | 7187804 | For dissection (depression wells can be used instead) |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Delicate task wipers |
| Leica Fluorescent Stereo Microscope M165 FC | Leica | For ovary imaging | |
| Microscope Slides | Corning | 294875X25 | Microscope Slides |
| Nutating platform rocker | Corning Life Sciences | 6720 | For ovary fixation and staining |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldehyde 20% Solution | Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific: 15713 | For PFA 4% |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher scientific | BP2944100 | For PBS solution |
| ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Mounting Medium |
| Square Cover Glass | Corning | 285022 | Cover glass for microscope slides |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | For PBST |
| Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 | Zeiss | Confocal and super-resolution Microscope | |
| Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope | Zeiss | Dissecting microscope | |
| Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Image acquisition and processing |
References
- Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
- Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
- Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
- Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
- Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660 (2013).
- Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
- Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
- Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
- Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
- Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59 (2016).
- Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
- Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
- McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
- Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
- Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), 3805-3815 (2006).
- Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
- Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
- Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
- Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Biologie du développement. 227 (2), 690-705 (2000).
- Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
- Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
- Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
- Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
- Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
- Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050 (2001).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Génétique. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Génétique. 201 (3), 815-842 (2015).
- Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Génétique. 211 (1), 15-34 (2019).
- Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
- Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
- Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
- Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, 111-130 (2021).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
- Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377 (2020).
- Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648 (2020).
- He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754 (2019).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
- Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52 (2006).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, 21-28 (2015).
- Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629 (2019).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Génétique. 208 (1), 1-18 (2018).
