वर्तमान प्रोटोकॉल तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण से पहले ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (टीसीए) प्रोटीन वर्षा और एसिड हाइड्रोलिसिस के माध्यम से जैविक मैट्रिक्स से गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड के निष्कर्षण का वर्णन करता है।
गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड (एनपीएए) अमीनो एसिड (एए) का एक बड़ा वर्ग है जो प्रोटीन में अनुवाद के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड नहीं हैं। एनपीएए का विश्लेषण सेलुलर अपटेक और / या फ़ंक्शन, चयापचय मार्गों और संभावित विषाक्तता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। β-मिथाइलएमिनो-एल-एलानिन (बीएमएए) विभिन्न शैवाल प्रजातियों द्वारा निर्मित एक न्यूरोटॉक्सिक एनपीएए है और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए बढ़ते जोखिम से जुड़ा हुआ है, जिसने महत्वपूर्ण शोध रुचि पैदा की है। विश्लेषण के लिए एए निकालने के कई तरीके हैं, तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री सबसे आम है, प्रोटीन पेलेट के एसिड हाइड्रोलिसिस के बाद प्रोटीन वर्षा की आवश्यकता होती है। अल्गल प्रजातियों में बीएमएए की उपस्थिति पर अध्ययन विरोधाभासी परिणाम प्रदान करते हैं, जिसमें अमान्य नमूना तैयारी / निष्कर्षण और विश्लेषण का उपयोग एक प्राथमिक कारण है। अधिकांश एनपीएए की तरह, 10% जलीय टीसीए में प्रोटीन वर्षा और फ्यूमिंग एचसीएल के साथ हाइड्रोलिसिस बीएमएए और इसके आइसोमर्स एमिनोइथाइलग्लाइसिन (एईजी) और 2,4-डायमिनोब्यूट्रिक एसिड (2,4-डीएबी) के लिए निष्कर्षण का सबसे उपयुक्त रूप है। वर्तमान प्रोटोकॉल आमतौर पर अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली एक मान्य एनपीएए निष्कर्षण विधि में चरणों का वर्णन करता है।
अमीनो एसिड रासायनिक यौगिक होते हैं जिनमें कम से कम एक अमाइन और कार्बोक्जिलिक कार्यात्मक समूह होता है। कुछ अमीनो एसिड में एक इमिनो समूह भी होता है, कार्बोक्जिलिक के अलावा एक कार्यात्मक एसिड समूह; अन्य अमीनो एसिड में अमाइन समूह होते हैं जो α-कार्बन समूह1 से जुड़े नहीं होते हैं। 500 से अधिक अमीनो एसिड हैं2, जिनमें से 22 को राइबोसोमल प्रोटीन संश्लेषण 3 में आनुवंशिक कोडिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन अमीनो एसिड के रूप में जाना जाताहै। इन 22 अमीनो एसिड को आगे आवश्यक और गैर-आवश्यक में विभाजित किया जा सकता है। एक जीव को ठीक से काम करने के लिए आवश्यक अमीनो एसिड आवश्यक हैं और केवल बाहरी स्रोतों द्वारा प्राप्त किए जा सकते हैं। गैर-आवश्यक अमीनो एसिड जीव के भीतर संश्लेषित किया जा सकता है। 22 अमीनो एसिड का आवश्यक / गैर-आवश्यक में वर्गीकरण व्यक्तिगत प्रजातियों के लिए अद्वितीय है। अन्य सभी अमीनो एसिड गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड (एनपीएए) हैं जो प्रोटीन संश्लेषण के लिए एन्कोडेड नहीं हैं। अमीनो एसिड, चाहे प्रोटीन या गैर-प्रोटीन, एक जीव के भीतर एक सिग्नलिंग भूमिका भी निभा सकते हैं और चयापचयमध्यस्थों के रूप में कार्य कर सकते हैं। उनकी महत्वपूर्ण और अलग-अलग भूमिकाओं के कारण, अमीनो एसिड का स्तर जीव की स्थिति, कार्यक्षमता और चयापचय मार्गों आदि में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। दो मुख्य तंत्र हैं जिनके द्वारा अमीनो एसिड को पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में शामिल किया जा सकता है: राइबोसोमल प्रोटीन संश्लेषण, जो एन्कोडिंग में 22 अमीनो एसिड का उपयोग करता है, और गैर-राइबोसोमल पेप्टाइड संश्लेषण, जो प्रोटीन अमीनो एसिड के साथ, संश्लेषण में कुछ एनपीएए के उपयोग की अनुमति देता है। कुछ एनपीएए प्रोटीन अमीनो एसिड की नकल कर सकते हैं, संभावित रूप से पेप्टाइड्स और प्रोटीन में उनके गलत समावेश का कारण बन सकते हैं। गलत निगमन प्रोटीन के मिसफोल्डिंग का कारण बनता है, जो बदले में, हानिकारक प्रभावडालता है, जैसे कि टायरोसिन के स्थान पर एनपीएए एल -3,4 डायहाइड्रोक्सीफेनिलएलनिन (एल-डोपा) का गलत निगमन, सेलुलर फ़ंक्शन और स्वास्थ्य 6,7 को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। शामिल एनपीएए का एक अतिरिक्त स्रोत अमीनो एसिड अवशेषों के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) के माध्यम से है। अमीनो एसिड अवशेषों को विभिन्न कारणों से संशोधित किया जाता है, जिसमें पेप्टाइड या प्रोटीन रचना, स्थिरता और कार्यक्षमता में परिवर्तन शामिल हैं। पीटीएम युक्त प्रोटीन या पेप्टाइड्स के हाइड्रोलिसिस पर, इन संशोधित अमीनो एसिड अवशेषों को उनके मुक्त एनपीएए फॉर्म 8,9 में जारी किया जाता है।
साइनोबैक्टीरिया, डायटम और डाइनोफ्लैगलेट्स10 द्वारा निर्मित एनपीएए β-मिथाइलएमिनो-एल-एलेनिन (बीएमएए) एक संदिग्ध न्यूरोटॉक्सिन है जिसे विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस / पार्किंसनिज़्म-डिमेंशिया कॉम्प्लेक्स (एएलएस-पीडीसी) 11,12, एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस और अल्जाइमर रोग13 के लिए एक योगदान कारक के रूप में फंसाया जाता है। . यह सुझाव दिया जाता है कि बीएमएए को गलती से एल-सेरीन14 और / या अन्य प्रोटीन अमीनो एसिड के स्थान पर प्रोटीन की पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में शामिल किया जाता है। बीएमएए के गलत निगमन से प्रोटीन की मिसफोल्डिंग हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स 14 में प्रोटीन समुच्चय का जमाव होसकता है। पिछले दशक में, बीएमएए में रुचि काफी बढ़ी है। मीठे पानी, समुद्री और खारे वातावरण से साइनोबैक्टीरियल प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला को बीएमएए15 का उत्पादन करने के लिए खोजा गया है, जिससे विभिन्न पारिस्थितिकतंत्रों में उनका व्यापक वितरण 16,17 हो गया है। इसके अतिरिक्त, बीएमएए को खाद्य श्रृंखला के माध्यम से मानव खाद्य वेब18,19 में बायोमैग्नेफाई करने के लिए दिखाया गया है। संभावित स्वास्थ्य प्रभावों, समझ की कमी और बीएमएए विषाक्तता की असंगतता के कारण, आगे के शोध को जारी रखना अनिवार्य है जब तक कि बीएमएए की विषाक्तता को अंततः समझा नहीं जाता है या बीएमएए को सुरक्षित माना जाता है।
जैविक नमूनों में अमीनो एसिड के विश्लेषण को चार मुख्य चरणों में विभाजित किया जा सकता है: नमूना तैयार करना, एमिनो एसिड व्युत्पन्न, पृथक्करण और पता लगाना, और पहचान और परिमाणीकरण। तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) पसंदीदा विश्लेषण विधि है क्योंकि यह अमीनो एसिड का लक्षित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पृथक्करण और विश्लेषण प्रदान करता है।
साइनोबैक्टीरियल और अन्य अल्गल नमूनों का विश्लेषण करने के लिए नमूना तैयारी तकनीकों में मुख्य रूप से अमीनो एसिड के लिए उनके मुक्त और प्रोटीन-बाध्य रूपों में एक निष्कर्षण विधि शामिल है। वर्षों से, निष्कर्षण विधियां सामान्य तत्वों के साथ अपेक्षाकृत सुसंगत रही हैं, जिसमें मुक्त अमीनो एसिड को उनके बाध्य रूप से अलग करने के लिए नमूने का विघटन शामिल है, इसके बाद प्रोटीन वर्षा और उच्च तापमान पर हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ हाइड्रोलिसिस के माध्यम से बाध्य अमीनो एसिड की रिहाईशामिल है। . इस निष्कर्षण रूप को प्रोटीन अमीनो एसिड के लिए अनुकूलित किया गया है और एनपीएए के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि, सायनोबैक्टीरिया की एक ही प्रजाति में बीएमएए और इसके आइसोमर्स (चित्रा 1), एमिनोइथाइलग्लाइसिन (एईजी) और 2,4-डायमिनोब्यूट्रिक एसिड (2,4-डीएबी) का पता लगाने और परिमाणीकरण ने साहित्य में असंगत परिणाम दिखाए हैं, जिसमें विकास की स्थिति और / या शैवाल के तनाव में अंतर है जो बीएमएए23 की अलग-अलग या कोई मात्रा पैदा नहीं करता है। . यह तर्क दिया गया है कि बीएमएए और इसके आइसोमर्स का पता लगाने और परिमाणीकरण में विसंगतियों के लिए एक अधिक संभावित स्पष्टीकरण अमान्य प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, विश्लेषणात्मक तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के उपयोग और रिपोर्ट किए गए तरीकों में अपर्याप्त प्रयोगात्मक विवरणके कारण है। हालांकि, ग्लोवर एट अल.25 और बैनैक26 ने हाल ही में इंटरनेशनल सोसाइटी ऑफ एनालिटिकल केमिस्ट्स (एओएसी), यूएस फार्माकोपिया और एकल-प्रयोगशाला सत्यापन के लिए आवश्यक एफडीए दिशानिर्देशों के अनुसार अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (यूपीएलसी)-एमएस/एमएस का उपयोग करके बीएमएए और इसके आइसोमर्स का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए एक विश्लेषणात्मक तकनीक विकसित और मान्य की है।
इन सत्यापन प्रयोगों ने बीएमएए और उसके आइसोमर्स के पृथक्करण और पता लगाने पर ध्यान केंद्रित किया और नमूना तैयारी प्रोटोकॉल में विसंगतियों को संबोधित नहीं किया। एलसी-एमएस / एमएस के माध्यम से साइनोबैक्टीरियल नमूनों में बीएमएए और इसके आइसोमर्स को निर्धारित करने के लिए तीन सामान्य निष्कर्षण विधियों के प्रदर्शन की तुलना की: मुक्त अमीनो एसिड28,29 के ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई); मेथनॉल निष्कर्षण और एसीटोन वर्षा30 से जुड़ी एक प्रोटीन वर्षा विधि; और बीएमएए के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली निष्कर्षण विधि, ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (टीसीए) 31 के साथ प्रोटीन वर्षा। उन्होंने निष्कर्ष निकाला कि टीसीए प्रोटीन वर्षा इष्टतम प्रोटोकॉल था, जिससे अन्य निष्कर्षण विधियों की तुलना में परीक्षण नमूनों में उच्च बीएमएए सांद्रता प्राप्त हुई। उनके अध्ययन ने एक साइनोबैक्टीरिया मैट्रिक्स में 6-एमिनोक्विनोलिन-एन-हाइड्रॉक्सीसुकिनिमिडिल कार्बामेट (एक्यूसी) का उपयोग करके बीएमएए के व्युत्पन्नीकरण के साथ टीसीए निष्कर्षण को मान्य किया, जो विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बीएमएए डेटा प्राप्त करने के लिए एक स्थापित मार्गदर्शिका प्रदान करता है। टीसीए एमिनो एसिड निष्कर्षण एक स्वीकृत और सामान्य नमूना तैयारी तकनीक है जिसे अन्य मैट्रिक्स पर भी लागू किया जा सकता है। हालांकि, हाइड्रोलिसिस के दौरान अमीनो एसिड की स्थिरता को गिरावट या ऑक्सीकरण को रोकने के लिए विचार करने की आवश्यकता है, जिसे रासायनिक संशोधक के उपयोग और एजेंटों को कम करने के साथ दूर किया जा सकताहै। टीसीए निष्कर्षण नियमित रूप से नए शोध छात्रों को उपयोग और सिखाया जाता है, और हालांकि प्रोटोकॉल व्यापक रूप से रिपोर्ट किया जाता है, इस पद्धति के आवेदन में एक दृश्य सहायता एक मूल्यवान संसाधन है, जो उचित और सुसंगत निष्पादन सुनिश्चित करती है।
रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी का उपयोग आमतौर पर अमीनो एसिड को अलग करने के लिए किया जाता है, जिसके विश्लेषण से पहले एक व्युत्पन्न चरण की आवश्यकता होती है। बीएमएए जैसे अमीनो एसिड का अपघटन क्रोमैटोग्राफिक प्रतिधारण की अनुमति देता है और आइसोमर्स के बीच संकल्प बढ़ा सकता है। यह आणविक द्रव्यमान को भी बढ़ाता है और द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर में आयनीकरण में सुधार करता है। एमएस के माध्यम से अमीनो एसिड के विश्लेषण के लिए कई व्युत्पन्न अभिकर्मकों का उपयोग किया गया है, जिसमें प्रोपाइल क्लोरोफॉर्मेट (पीसीएफ) 33, 6-एमिनोक्विनोलिन-एन-हाइड्रोसिसुसिकिनिमिडिल कार्बामेट (एक्यूसी)27, 9-फ्लोरेनिलमिथाइलमिथाइल क्लोरोफॉर्मेट (एफएमओसी)34, और डैनसिल क्लोराइड (डीसी)35 शामिल हैं। हालांकि, बीएमएए का विश्लेषण करने के लिए एकमात्र मान्यतकनीकों ने पीसीएफ 36 या एक्यूसी 24,26,37 को अपने उपहास अभिकर्मक के रूप में इस्तेमाल किया।
इस प्रोटोकॉल का दायरा साइनोबैक्टीरियल मैट्रिसेस से एनपीएए के टीसीए निष्कर्षण पर केंद्रित है। यह एक श्रम-गहन विधि है जिसे नियमित रूप से अकादमिक और उद्योग अनुसंधान प्रयोगशालाओं में पांडुलिपियों के आधार पर उपयोग और पढ़ाया जाता है जो विस्तार से कम हो सकते हैं; इसलिए, यह प्रोटोकॉल मॉडल एमिनो एसिड के रूप में मुक्त और बाध्य बीएमएए के विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने में शामिल प्रक्रिया और तकनीकों का विवरण प्रदान करता है।
एनपीएए के विश्लेषण के लिए यहां उल्लिखित निष्कर्षण प्रोटोकॉल जैविक नमूनों में किसी भी एमिनो एसिड का विश्लेषण करने पर लागू होता है। साइनोबैक्टीरियल उपभेदों को अलग करने और संवर्धन करने पर गाइड के लिए, कोई भी वियोली एट अल.38 द्वारा अध्ययन में प्रस्तुत तरीकों का उल्लेख कर सकता है। प्रोटोकॉल में पहला कदम नमूना को एक बिंदु पर ले जाता है जहां सूखे वजन के खिलाफ नमूनों के बीच सामान्यीकरण प्राप्त किया जा सकता है। दूसरा चरण विश्लेषणों को जारी करने के लिए सेल लाइसिस है और इसे तकनीकों की एक सरणी का उपयोग करके किया जा सकता है, जिसमें यांत्रिक व्यवधान / लाइसिस जैसे कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित जांच सोनिकेशन, फ्रीज / पिघलना चक्र, पीसना और मोती मिलिंग, और गैर-यांत्रिक व्यवधान जैसे एंजाइमेटिक, डिटर्जेंट और / या रासायनिक लाइसिस शामिल हैं। यांत्रिक व्यवधान को गैर-यांत्रिक पर फायदेमंद माना जाता है क्योंकि यह इंट्रासेल्युलर बॉन्ड और प्रोटीनको बरकरार रखने की अनुमति देते हुए नमूने की अधिक क्षमता को लाइज़ करने की अनुमति देता है, हालांकि नमूना मैट्रिक्स सेल लाइसिंग के लिए इष्टतम विधि को निर्देशित कर सकता है।
विश्लेषण के लिए अमीनो एसिड निकालते समय प्रोटीन वर्षा इस प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण तीसरा चरण है। टीसीए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला विलायक है; हालांकि, परक्लोरिक एसिड, एसीटोन, मिथाइल टर्ट-ब्यूटाइल ईथर (एमटीबीई), मेथनॉल, और / या एसिटोनिट्राइल 8,42 का भी उपयोग किया गया है, जहां प्रत्येक निष्कर्षण विलायक का उद्देश्य विभिन्न सब्सट्रेट्स को निकालना और अवक्षेपित करना है। यहां वर्णित मॉडल एनपीएए बीएमएए और इसके आइसोमर्स को साइनोबैक्टीरियल मैट्रिक्स से निकालता है, और हालांकि विभिन्न सॉल्वैंट्स की एक श्रृंखला का उपयोग किया गया है, दो सबसे आम पानी (जलीय) में 10% टीसीए और एसीटोन में 10% टीसीए हैं। सामान्य तौर पर, टीसीए के साथ प्रोटीन वर्षा का उपयोग आमतौर पर प्रोटीन-बाध्य अमीनो एसिड से मुक्त अमीनो एसिड को अलग करने के लिए अमीनो एसिड निकालने के लिए किया जाता है। इसके अतिरिक्त, टीसीए निष्कर्षण कुल प्रोटीन सामग्री का निर्धारण करने, मुक्त अंश के लिए दूषित पदार्थों को कम करने और न्यूनतम प्रोटीन गिरावट के साथ प्रोटीज की गतिविधि को कम करने की अनुमतिदेता है। मुक्त अंश का टीसीए निष्कर्षण शुरू में कार्बनिक घुलनशील पदार्थों को धोकर काम करता है, प्रोटीन और अघुलनशील यौगिकों जैसे कि अवक्षेप में सेल दीवार अवशेष ों को पीछे छोड़ देता है, जिसके बाद एक मजबूत एसिड का उपयोग करके प्रोटीन-बाध्य अमीनो एसिड (बाध्य अंश) का थर्मल हाइड्रोलिसिस निष्कर्षण होता है।
10% जलीय टीसीए प्लस सोनिकेशन के साथ मुक्त अंश का विभाजन अन्य कार्बनिक सॉल्वैंट्स44 की तुलना में सबसे व्यापक प्रोटीन वर्षा पैदा करता है और सबसे अच्छा एमिनो एसिड रिकवरी42 है। कुछ अध्ययन एक कार्बनिक विलायक (यानी, एसीटोन43 में 10% -20% टीसीए) के साथ संयुक्त एसिड का उपयोग करने का विकल्प चुनते हैं, ताकि छोटे पेप्टाइड्स / बायोमोलेक्यूल्स सहित अधिक अणुओं को अवक्षेपित किया जा सके, प्रोटीन क्षरण को कम किया जा सके, और लवण43 जैसे दूषित पदार्थों को कम किया जा सके। एसीटोन में 10% टीसीए का एक और लाभ हाइड्रोलिसिस के लिए गोली की तैयारी में इसकी तेजी से सुखाने की दर है, एमिनो एसिड संशोधन को रोकने के लिए नमी अवशेषों को कम करना। हालांकि, अकेले एसीटोन44 में 10% टीसीए की तुलना में 10% जलीय टीसीए प्लस सोनिकेशन में मुक्त अमीनो एसिड की बेहतर निष्कर्षण क्षमता है। इसके अतिरिक्त, 10% जलीय टीसीए वर्षा की सीमाएं हैं जैसे कि लंबे समय तक सुखाने का समय, सभी प्रोटीन या छोटे पेप्टाइड्स / बायोमोलेक्यूल्स को अवक्षेपित करने में सक्षम नहीं होना, और रुचि के विश्लेषण (यानी, प्रोटीन या अमीनो एसिड) के आधार पर, ऑक्सीकरण और गिरावट को रोकने के लिए एडिटिव्स की आवश्यकता होती है और एजेंटों को कम करना45,46।
यह प्रोटोकॉल प्रोटीन वर्षा बढ़ाने के लिए एसीटोन में 10% जलीय टीसीए और 10% टीसीए के संयोजन का उपयोग करता है, यह सुनिश्चित करता है कि छोटे पेप्टाइड्स / बायोमोलेक्यूल्स अवक्षेपित हों, तेजी से पेलेट सुखाने के समय की अनुमति दें, और निष्कर्षण क्षमता में वृद्धि करें, दोनों विलायक निष्कर्षण गुणों का लाभ उठाएं। हालांकि, एसीटोन में 10% जलीय टीसीए और 10% टीसीए का संयोजन मुक्त अंश में छोटे पेप्टाइड्स / बायोमोलेक्यूल्स को अवक्षेपित कर सकता है जब एसीटोन सुपरनैटेंट में 10% टीसीए जलीय मुक्त अंश के साथ जोड़ा जाता है। इस मामले में, अवक्षेप को हाइड्रोलिसिस के लिए बाध्य अंश में स्थानांतरित किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में ऑक्सीजन मुक्त वातावरण में ऊंचे तापमान पर एसिड-वाष्प हाइड्रोलिसिस के माध्यम से प्रोटीन गोली से अमीनो एसिड (यानी, बीएमएए) की रिहाई शामिल है। हाइड्रोलिसिस चरण के लिए मुख्य रूप से सीमित कारक यह है कि यह तैयार करने में समय लेने वाला और श्रमसाध्य है। रातोंरात इनक्यूबेशन तेजी से और समय-कुशल नमूना तैयारी और विश्लेषण को रोकता है। इसके अलावा, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से शेल शीशी (चरण 3.4) में गोली का मात्रात्मक हस्तांतरण एक कठिन प्रक्रिया है जिसके लिए सूखे वजन के सामान्यीकरण के सटीक बिंदु को सुनिश्चित करने के लिए परिश्रम और धैर्य की आवश्यकता होती है। उपयोगकर्ता को होने वाली संभावित समस्याओं में गोली का अधूरा हस्तांतरण, पिपेट युक्तियों और मूल ट्यूब से चिपके गीले अवक्षेपित प्रोटीन और पिपेट टिप को अवरुद्ध करने वाले गोली के ठोस कण शामिल हैं। पेलेट के आसान हस्तांतरण में सहायता करने में एक व्यावहारिक सुझाव कैंची की एक जोड़ी के साथ पिपेट टिप के अंत से लगभग 0.3-0.5 मिमी निकालना है, जिससे बड़े पेलेट कणों को खींचने और शेल शीशी में छोड़ने की अनुमति मिलती है। यह स्थानांतरण विधि सभी अमीनो एसिड विश्लेषणों के लिए प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सामान्य अभ्यास है। हालांकि, शेल शीशी में पेलेट को मात्रात्मक रूप से स्थानांतरित करने की दक्षता और सटीकता में सुधार के लिए संशोधनों की जांच की जानी चाहिए।
हाइड्रोलिसिस तकनीकों के दो रूपों को उनके प्रोटीन-बाध्य अवस्था से अमीनो एसिड जारी करने के लिए नियोजित किया जा सकता है: तरल-चरण हाइड्रोलिसिस और एसिड-वाष्प हाइड्रोलिसिस। तरल-चरण हाइड्रोलिसिस, जिसमें नमूने पर 6 एम एचसीएल को जोड़ना शामिल है, जिसे बाद में रात भर 110 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखा जाता है, इस प्रोटोकॉल में वर्णित एसिड-वाष्प हाइड्रोलिसिस का एक विकल्प है। निष्कर्षण तकनीक जो तरल-चरण हाइड्रोलिसिस को नियोजित करती हैं, उन्हें आगे के प्रसंस्करण की आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि विलवणीकरण, खासकर यदि एक्यूसी व्युत्पन्न को चुना जाता है, क्योंकिइसे टैग करने के लिए बुनियादी शर्तों की आवश्यकता होती है। एसिड-वाष्प हाइड्रोलिसिस विलवणीकरण से बचता है और उपयोगकर्ता को निस्पंदन से पहले अंतिम गोली के पुनर्गठन पर व्युत्पन्न तकनीक चुनने की स्वतंत्रता देता है। इसके अलावा, चुने हुए हाइड्रोलिसिस विधि से स्वतंत्र, नमूनों को आगे के प्रसंस्करण की आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि मैट्रिक्स शुद्धिकरण और एकाग्रता 29,47,48 के लिए एसपीई, व्युत्पन्न तकनीक और / या विश्लेषणात्मक विश्लेषण (जैसे, रिवर्स चरण एलसी-एमएस / एमएस बनाम हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन तरल क्रोमैटोग्राफी [एचआईएलआईसी] एलसी-एमएस / एमएस37) की पसंद के आधार पर। ). इस प्रोटोकॉल में 20 एमएम एचसीएल में अंतिम गोली का पुनर्गठन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अमीनो एसिड हाइड्रोलिसिस किट39 के माध्यम से पीसीएफ अभिकर्मकों48 का उपयोग करके व्युत्पन्नीकरण के लिए उपयुक्त है (सामग्री की तालिका देखें)। AQC और PCF दोनों नमूने में मौजूद मूल रूप से सभी अमीनो एसिड, प्रोटीन और गैर-प्रोटीन को व्युत्पन्न करेंगे, और विश्लेषणों की चयनात्मकता एलसी-एमएस / एमएस के उपयोग और प्रतिधारण समय मिलान और क्वांटिफायर और क्वालीफायर एमआरएम38 के सावधानीपूर्वक चयन के संयोजन के माध्यम से प्राप्त की जाती है।
वर्तमान हाइड्रोलिसिस प्रोटोकॉल बीएमएए, 2,4-डीएबी और एईजी की रिहाई के लिए अनुकूलित नहीं हैं, लेकिन प्रोटीन हाइड्रोलिसिस 32 के लिए मौजूदा तरीकों के आधार पर22 प्रोटीन अमीनो एसिड के लिए, जहां 18 घंटे से अधिक समय तक इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप कुछ अमीनो एसिड का क्षरण और संशोधन होता है, जो एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण को प्रभावित करता है और इस प्रकार, प्राप्त सांद्रता32 है। बीच एट अल .49 ने बीएमएए और प्रोटीनोजेनिक अमीनो एसिड का विश्लेषण करने के लिए हाइड्रोलिसिस को अनुकूलित करने के लिए समय (0.5-120 घंटे) के साथ हाइड्रोलिसिस की जांच की। उन्होंने पाया कि हालांकि हाइड्रोलिसिस के पहले 0.5 घंटे के दौरान बीएमएए की शुरुआती तेजी से रिहाई हुई थी, बीएमएए के स्तर में वृद्धि जारी रही क्योंकि हाइड्रोलिसिस समय में वृद्धि हुई, बिना गिरावट के, 5 दिनोंके बाद भी। बाध्य बीएमएए और उसके आइसोमर्स की वास्तविक प्रकृति के बारे में अभी भी अलग-अलग विचार और प्रश्न हैं, कुछ अध्ययनों से पता चलता है कि बीएमएएबॉन्डिंग 50,51 या प्रोटीन 14 में गलत समावेश के बजाय, बीएमएए-प्रोटीन एसोसिएशन सतही52 है। हालांकि, “बाध्य” बीएमएए के विश्लेषण में वर्तमान सहमति के लिए मान्य और व्यापक रूप से स्वीकृत हाइड्रोलिसिस चरण की आवश्यकता होती है जो अमीनो एसिड जारी करने के लिए पेप्टाइड्स / प्रोटीन को तोड़ता है और इस प्रकार, बीएमएए और इसके आइसोमर्स।
टीसीए निष्कर्षण का उपयोग करके सेडविक एट अल.42 द्वारा एक अध्ययन में 20 प्रोटीन अमीनो एसिड की वसूली दर निर्धारित की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 100% वसूली हुई। अल्गल मैट्रिसेस से बीएमएए और इसके आइसोमर्स के मामले में, विभिन्न निष्कर्षण सॉल्वैंट्स का उपयोग करके बीएमएए निष्कर्षण की दक्षता की तुलना करने वाले अध्ययनों ने 10% टीसीए को मुफ्त बीएमएए27 के लिए सबसे कुशल पाया है। तरल-चरण हाइड्रोलिसिस का उपयोग करके निकाले गए प्रोटीन-बाध्य बीएमएए के लिए वसूली दर ग्लोवर एट अल.25 और फासेन एट अल.53 द्वारा अध्ययनों में स्थापित की गई थी, जहां सटीकता क्रमशः 108.6% और 70% की औसत बीएमएए वसूली दर के साथ स्पाइक रिकवरी विधियों द्वारा निर्धारित की गई थी। फासेन एट अल ने स्पाइक-रिकवरी प्रयोगों के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया और बताया कि निष्कर्षण प्रक्रिया के चरण के आधार पर रिकवरी कैसे भिन्न होतीहै। फासेन एट अल ने यहां प्रस्तुत एसिड-वाष्प प्रोटोकॉल की दक्षता को भी निर्धारित किया, जिसमें निष्कर्षण से पहले बीएमएए आइसोमर्स के लिए 83.6% की वसूली दर और हाइड्रोलिसिस24 से पहले स्पाइक किए गए लोगों के लिए 68.6% थी। इन पुनर्प्राप्तियों, निष्कर्षण के तरीकों और विश्लेषणों को बैनैक26 द्वारा आगे मान्य किया गया, जिसमें साइनोबैक्टीरियल मैट्रिक्स में बीएमएए के लिए 94% -106% की वसूली दर और 5.6% और 20% के बीच % सापेक्ष मानक विचलन (% आरएसडी) था, जो सटीकता के लिए एफडीएमानदंडों को पूरा करता था। यह अनुशंसा की जाती है कि स्पाइक रिकवरी प्रयोगों के माध्यम से इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले प्रत्येक प्रयोगशाला शुरू में अपनी वसूली दर और सटीकता स्थापित करे। फासेन एट अल.53 और ग्लोवर एट अल.25 में प्रस्तुत पुनर्प्राप्ति विधियों को एक गाइड के रूप में पालन किया जा सकता है।
विश्लेषण के तेजी से प्रोटीन-बाध्य निष्कर्षण के लिए रात भर ओवन हाइड्रोलिसिस के बजाय हाइड्रोलिसिस तकनीकों के वैकल्पिक रूपों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक माइक्रोवेव एक्सट्रैक्टर हाइड्रोलिसिस समय को 24 घंटे से 10 मिनट55 तक कम कर सकता है। अमीनो एसिड के लिए माइक्रोवेव हाइड्रोलिसिस पारंपरिक थर्मल विधि के समान सिद्धांतों का उपयोग करता है, ऑक्सीजन मुक्त वातावरण में माइक्रोवेव पोत को तैयार करने और इकट्ठा करने के लिए एक दस्ताने बॉक्स का उपयोग करता है और 6 एम एचसीएल जोड़ता है। एक बार एयर-टाइट होने के बाद, नमूना युक्त पोत माइक्रोवेव विकिरण से गुजरता है। माइक्रोवेव हाइड्रोलिसिस का उपयोग विभिन्न नमूना मैट्रिसेस56,57,58 से अमीनो एसिड निकालने के लिए किया गया है; हालांकि, माइक्रोवेव हाइड्रोलिसिस को अभी तक विकसित नहीं किया गया है और बीएमएए के विश्लेषण के लिए मान्य किया गया है।
निष्कर्ष में, 10% जलीय टीसीए प्रोटीन वर्षा साइनोबैक्टीरियल मैट्रिसेस27 से मुक्त गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड निकालने के लिए इष्टतम विधि है, और थर्मल हाइड्रोलिसिस प्रोटीन-बाध्य अंश का एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निष्कर्षण प्रदान करता है। साइनोबैक्टीरिया से एनपीएए बीएमएए और इसके आइसोमर्स निकालने के लिए यह प्रोटोकॉल मान्य और व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है। बीएमएए के निष्कर्षण को और अनुकूलित करने के लिए भविष्य के निर्देश हाइड्रोलिसिस चरण पर ध्यान केंद्रित करेंगे, जो 22 प्रोटीन अमीनो एसिड के विनिर्देशों के अनुसार किया जाता है। हालांकि, यहां प्रस्तुत निष्कर्षण प्रोटोकॉल को अभी भी एलसी-एमएस / एमएस के माध्यम से बीएमएए और इसके आइसोमर्स का विश्लेषण करने के लिए कुशल और प्रभावी माना जाना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
डी.पी.बी., के.जे.आर., और एस.एम.एम. को द इयान पॉटर फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया जाता है, और जे.पी.वी. एक ऑस्ट्रेलियाई सरकारी अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम, वजीफा के प्राप्तकर्ता हैं।
1 mL glass shell vials | SHIMADZU | REST-24663 | |
10% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA | ||
100% TCA solution | Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O) | ||
1000 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z683809 | |
13.3% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA | ||
2 mL tubes | MERCK | BR780546-500EA | |
20 mM HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
20-200 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z740441 | |
6 M HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
70% ethanol | Supelco | 1.11727 | Dilute 70:1 Ethanol:water |
-80 °C Freezer | Martin CHRIST | 102142 | Alpha 2-4 Ldplus |
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit | Waters | 186003836 | |
Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | 34967-2.5L | |
Analytical Scale Balance | |||
Centrifugal evaporator | Thermo Scientific | 13442549 | DNA120-115 SpeedVac Concentrator |
Centrifuge | MERCK | EP022620100-1EA | |
D5-2,4-DAB standard | CDN Isotopes | D-7568 | |
Drying Oven | |||
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit | Phenomenex | CEO-8492 | |
Falcon tube holder | |||
Falcon Tubes | MERCK | T2318-500EA | Greiner centrifuge tubes |
Filter Tubes | Sigma-Aldrich | CLS8161-100EA | Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm) |
Glass engraver | |||
Hydrolysis vial & Lid | Eldex Laboratories/Waters | WAT007568 & WAT007569 | |
Ice and container | |||
Lint-free paper wipe | Kimwipes/Sigma-Aldrich | Z188956 | |
Milli-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
Nitrogen tap with hose | |||
P1000 Micropipette | MERCK | EP3123000063 | |
P1000 pipette tips | MERCK | Z740127 | |
P200 Micropipette | MERCK | EP3123000055-1EA | |
P200 pipette tips | MERCK | Z740125 | |
Parafilm | MERCK | P7793 | Sealing film |
PPE – noise cancelling headphones | |||
PPE – oven gloves | |||
Probe sonicator | QSONICA Sonicators | Q125 Sonicator | Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones) |
Sample transfer spatula | |||
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399-1KG | |
Tweezers | |||
Vacuum Pump with hose |