Hydrogelarrays muliggør øget gennemstrømning til screeningseffekter af matrixkomponenter og terapi i 3D-tumormodeller
Summary
Denne protokol beskriver en eksperimentel platform til vurdering af virkningerne af mekaniske og biokemiske signaler på kemoterapeutiske reaktioner af patientafledte glioblastomceller i 3D-matrixmimetiske kulturer ved hjælp af en specialfremstillet UV-belysningsenhed, der letter fotocrosslinking med høj kapacitet af hydrogeler med indstillelige mekaniske egenskaber.
Abstract
Cellematrixinteraktioner medierer komplekse fysiologiske processer gennem biokemiske, mekaniske og geometriske signaler, der påvirker patologiske ændringer og terapeutiske reaktioner. Regnskab for matrixeffekter tidligere i lægemiddeludviklingspipelinen forventes at øge sandsynligheden for klinisk succes med nye terapier. Biomaterialebaserede strategier, der rekapitulerer specifikke vævsmikromiljøer i 3D-cellekultur, findes, men det har været udfordrende at integrere disse med de 2D-dyrkningsmetoder, der primært anvendes til lægemiddelscreening. Protokollen, der præsenteres her, beskriver således udviklingen af metoder til 3D-kultur inden for miniaturiserede biomaterialematricer i et multi-well pladeformat for at lette integrationen med eksisterende lægemiddelscreeningsrørledninger og konventionelle assays for cellelevedygtighed. Da matrixens egenskaber, der er afgørende for at bevare klinisk relevante fænotyper i dyrkede celler, forventes at være meget vævs- og sygdomsspecifikke, vil kombinatorisk screening af matrixparametre være nødvendig for at identificere passende betingelser for specifikke anvendelser. De metoder, der er beskrevet her, bruger et miniaturiseret kulturformat til at vurdere kræftcelleresponser på ortogonal variation af matrixmekanik og ligandpræsentation. Specifikt demonstrerer denne undersøgelse brugen af denne platform til at undersøge virkningerne af matrixparametre på responsen af patientafledte glioblastomceller (GBM) på kemoterapi.
Introduction
De forventede omkostninger ved at udvikle et nyt lægemiddel er steget støt i løbet af det sidste årti med over 1 mia. USD i de nuværende skøn1. En del af denne udgift er den høje fejlrate for lægemidler, der indgår i kliniske forsøg. Ca. 12% af lægemiddelkandidaterne tjener i sidste ende godkendelse fra USA (US) Food &drug Administration (FDA) i 2019. Mange lægemidler fejler i fase I på grund af uventet toksicitet2, mens andre, der består sikkerhedsforsøg, kan mislykkes på grund af manglende effekt3. Denne nedslidning på grund af manglende effekt kan til dels forklares ved, at kræftmodeller, der anvendes under lægemiddeludvikling, notorisk ikke er prædiktive for klinisk effekt4.
Funktionelle forskelle mellem in vitro- og in vivo-modeller kan tilskrives fjernelse af kræftceller fra deres oprindelige mikromiljø, herunder ikke-tumorceller og den fysiske ECM 5,6. Almindeligvis bruger forskergrupper kommercielt tilgængelige kulturmatricer, såsom Matrigel (en proteinholdig kældermembranmatrix afledt af musesarkomer) til at tilvejebringe dyrkede tumorceller med et 3D-matrixmikromiljø. Sammenlignet med 2D-dyrkning har 3D-dyrkning i membranmatrix forbedret den kliniske relevans af in vitro-resultater 7,8. Imidlertid udviser kulturbiomaterialer fra decellulariseret væv, herunder membranmatrixen, typisk batch-til-batch-variabilitet, der kan kompromittere reproducerbarheden9. Desuden giver matricer afledt af tumorer med forskellig vævsoprindelse end de undersøgte muligvis ikke de relevante fysiologiske signaler10. Endelig har kræftformer med høje grader af intratumoral heterogenitet mikromiljøegenskaber, der varierer på en submikronstørrelsesskala, og som membranmatrixen ikke kan indstilles til at rekapitulere11.
Glioblastom (GBM), en ensartet dødelig hjernetumor med en median overlevelsestid på ca. 15 måneder, er en kræftform, for hvilken behandlingsudviklingen har været særlig vanskelig12,13. Den nuværende standard for pleje af GBM består af primær tumorresektion efterfulgt af strålebehandling og derefter kemoterapi ved hjælp af temozolomid (TMZ)14. Alligevel udviser mere end halvdelen af kliniske GBM-tumorer behandlingsresistens gennem forskellige mekanismer 15,16,17. Forudsigelse af effekten af et behandlingsregime for en individuel patient er ekstremt vanskelig. Standard prækliniske modeller, der bruges til at forudsige individuelle resultater, består af patientafledte tumorceller xenografteret ortopisk i immunkompromitterede mus. Mens patientafledte xenotransplantater kan rekapitulere mange aspekter af kliniske GBM-tumorer og er værdifulde for prækliniske modeller18, er de i sagens natur dyre, lave gennemstrømning, tidskrævende og involverer etiske bekymringer19. Kulturer af patientafledte celler, på 2D-plastoverflader eller som sfæroider, undgår for det meste disse problemer. Mens patientafledte celler bevarer genetiske afvigelser, har deres kulturer i 2D eller som suspenderede sfæroider stort set været dårlige repræsentationer af patientafledte xenotransplantater hos gnavere og originale patienttumorer20. Tidligere har vi og andre vist, at GBM-celler dyrket i en 3D ECM, der efterligner hjernevævets mekaniske og biokemiske egenskaber, kan bevare lægemiddelresistensfænotyper 10,21,22,23.
Interaktioner mellem hyaluronsyre (HA), et polysaccharid, der er rigeligt i hjernen ECM og overudtrykt i GBM-tumorer, og dets CD44-receptor modulerer erhvervelsen af lægemiddelresistens in vitro 21,24,25,26,27. For eksempel øgede inkluderingen af HA i bløde 3D-kulturer evnen hos patientafledte GBM-celler til at erhverve terapeutisk resistens. Denne mekano-responsivitet var afhængig af HA-binding til CD44-receptorer på GBM-celler21. Derudover forstærkede integrinbinding til RGD-bærende peptider, inkorporeret i 3D-kulturmatricer, CD44-medieret kemoresistens på en stivhedsafhængig måde21. Ud over HA varierer ekspressionen af flere ECM-proteiner, mange indeholdende RGD-regioner, mellem normale hjerne- og GBM-tumorer28. For eksempel rapporterede en undersøgelse, at 28 forskellige ECM-proteiner blev opreguleret i GBM-tumorer29. Inden for dette komplekse tumormatrixmikromiljø integrerer kræftceller mekaniske og biokemiske signaler for at give en bestemt resistensfænotype, som afhænger af relativt små forskelle (f.eks. Mindre end en størrelsesorden) i Youngs modul eller densitet af integrinbindende peptider 28,29,30.
Den nuværende protokol karakteriserer, hvordan tumorceller fortolker unikke kombinationer af matrixsignaler og identificerer komplekse, patientspecifikke matrixmikromiljøer, der fremmer behandlingsresistens (figur 1A). En fotokemisk metode til generering af miniaturiserede, præcist indstillede matricer til 3D-kultur giver et stort, ortogonalt variabelt rum. Et specialbygget udvalg af lysdioder, der drives af en mikrocontroller, blev inkorporeret i photocrosslink-hydrogeler inden for et 384-brønds pladeformat for at øge automatisering og reproducerbarhed. Eksponeringsintensiteten blev varieret på tværs af brønde for at ændre mikromekaniske egenskaber af resulterende hydrogeler, som vurderet ved hjælp af atomkraftmikroskopi (AFM). Selvom dette manuskript ikke fokuserer på at konstruere selve belysningsarrayet, leveres et kredsløbsdiagram (figur 1B) og delliste (materialetabel) som hjælpemidler til enhedsgengivelse.
Denne rapport demonstrerer den hurtige generering af en række GBM-celler dyrket i unikke 3D-mikromiljøer, hvor Youngs modul (fire niveauer over en enkelt størrelsesorden) og integrinbindende peptidindhold (afledt af fire forskellige ECM-proteiner) blev varieret ortogonalt. Metoden blev derefter brugt til at undersøge de relative bidrag fra hydrogelmekanik og ECM-specifikt integrinengagement på levedygtigheden og spredningen af patientafledte GBM-celler, når de erhverver resistens over for temozolomid (TMZ) kemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det nuværende arbejde præsenterer metoder til at generere 3D, miniaturiserede kulturer inden for HA-baserede, samtidig med at matrixstivhed og peptider, der er tilgængelige for integrininddragelse, ændres. Denne teknik muliggør systematisk undersøgelse af, hvordan matrixparametre påvirker cellulære fænotyper (f.eks. Levedygtigheden af kræftceller udsat for kemoterapi) med øget gennemstrømning. Tidligere tilgange, herunder den, der præsenteres heri, har indstillet hydrogelstivhed ved at variere den procentvis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne specifikt anerkende Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore og Itay Solomon for deres bidrag til tidligere iterationer af fotogelationsordningen. Cellelinjer GS122 og GS304 blev generøst leveret af David Nathanson. Alle figurer blev skabt med BioRender.com. UCLA kernefaciliteter, Molecular Screening Shared Resources og Nano and Pico Characterization Laboratory var medvirkende til arbejdet. Chen Chia-Chun blev støttet af UCLA Eli og Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan blev støttet af et tumorcellebiologiuddannelsesprogram NIH Grant (T32 CA 009056).
Materials
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
References
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology’s trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochimie. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Recherche en cancérologie. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, 68-77 (2015).
- Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer’s law – Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
