Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen
Summary
Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.
Abstract
Cel-matrix interacties bemiddelen complexe fysiologische processen door middel van biochemische, mechanische en geometrische signalen, die pathologische veranderingen en therapeutische reacties beïnvloeden. Rekening houden met matrixeffecten eerder in de pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen zal naar verwachting de kans op klinisch succes van nieuwe therapieën vergroten. Er bestaan op biomateriaal gebaseerde strategieën die specifieke weefselmicro-omgevingen in 3D-celkweek samenvatten, maar het integreren van deze met de 2D-kweekmethoden die voornamelijk worden gebruikt voor geneesmiddelenscreening is een uitdaging geweest. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft dus de ontwikkeling van methoden voor 3D-cultuur binnen geminiaturiseerde biomateriaalmatrices in een multi-well plaatformaat om integratie met bestaande medicijnscreeningpijplijnen en conventionele testen voor cel levensvatbaarheid te vergemakkelijken. Aangezien de matrixkenmerken die van cruciaal belang zijn voor het behoud van klinisch relevante fenotypen in gekweekte cellen naar verwachting zeer weefsel- en ziektespecifiek zullen zijn, zal combinatorische screening van matrixparameters nodig zijn om geschikte omstandigheden voor specifieke toepassingen te identificeren. De hier beschreven methoden gebruiken een geminiaturiseerd cultuurformaat om kankercelresponsen op orthogonale variatie van matrixmechanica en ligandpresentatie te beoordelen. Specifiek toont deze studie het gebruik van dit platform om de effecten van matrixparameters op de reacties van van patiënten afgeleide glioblastoom (GBM) cellen op chemotherapie te onderzoeken.
Introduction
De verwachte kosten van de ontwikkeling van een nieuw medicijn zijn het afgelopen decennium gestaag gestegen, met meer dan $ 1 miljard in de huidige schattingen1. Een deel van deze kosten is het hoge faalpercentage van geneesmiddelen die klinische onderzoeken ingaan. Ongeveer 12% van de kandidaat-geneesmiddelen verdient uiteindelijk goedkeuring van de Amerikaanse Food & Drug Administration (FDA) in 2019. Veel geneesmiddelen falen in fase I vanwege onverwachte toxiciteit2, terwijl anderen die veiligheidsonderzoeken doorstaan, kunnen mislukken vanwege een gebrek aan werkzaamheid3. Dit verloop als gevolg van niet-werkzaamheid kan gedeeltelijk worden verklaard door het feit dat kankermodellen die tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen worden gebruikt, notoir niet-voorspellend zijn voor klinische werkzaamheid4.
Functionele verschillen tussen in vitro en in vivo modellen kunnen worden toegeschreven aan het verwijderen van kankercellen uit hun oorspronkelijke micro-omgeving, waaronder niet-tumorcellen en de fysieke ECM 5,6. Gewoonlijk gebruiken onderzoeksgroepen commercieel verkrijgbare kweekmatrices, zoals Matrigel (een eiwitachtige keldermembraanmatrix afgeleid van muizencomen) om gekweekte tumorcellen te voorzien van een 3D-matrixmicro-omgeving. Vergeleken met 2D-cultuur heeft 3D-cultuur in membraanmatrix de klinische relevantie van in vitro resultaten verbeterd 7,8. Kweekbiomaterialen uit gedecellulariseerde weefsels, inclusief de membraanmatrix, vertonen echter meestal batch-to-batch variabiliteit die de reproduceerbaarheid in gevaar kan brengen9. Bovendien bieden matrices afgeleid van tumoren met een andere weefseloorsprong dan de bestudeerde mogelijk niet de juiste fysiologische signalen10. Ten slotte hebben kankers met een hoge mate van intratumorale heterogeniteit micro-omgevingskenmerken die variëren op een submicron-schaal en waarvan de membraanmatrix niet kan worden afgestemd om11 samen te vatten.
Glioblastoom (GBM), een uniform dodelijke hersentumor met een mediane overlevingstijd van ongeveer 15 maanden, is een kanker waarvoor de ontwikkeling van de behandeling bijzonder moeilijk is geweest12,13. De huidige zorgstandaard voor GBM bestaat uit primaire tumorresectie, gevolgd door radiotherapie en vervolgens chemotherapie met temozolomide (TMZ)14. Toch vertoont meer dan de helft van de klinische GBM-tumoren behandelingsresistentie via verschillende mechanismen 15,16,17. Het voorspellen van de werkzaamheid van een behandelingsregime voor een individuele patiënt is uiterst moeilijk. Standaard preklinische modellen die worden gebruikt om individuele uitkomsten te voorspellen, bestaan uit van patiënten afgeleide tumorcellen die orthotopisch zijn getransplanteerd in immuungecompromitteerde muizen. Hoewel patiënt-afgeleide xenografts veel aspecten van klinische GBM-tumoren kunnen samenvatten en waardevol zijn voor preklinische modellen18, zijn ze inherent duur, lage doorvoer, tijdrovend en brengen ze ethische problemen met zich mee19. Culturen van patiënt-afgeleide cellen, op 2D-plastic oppervlakken of als sferoïden, vermijden deze problemen meestal. Terwijl van patiënten afgeleide cellen genetische afwijkingen behouden, zijn hun culturen in 2D of als gesuspendeerde sferoïden grotendeels slechte representaties van patiënt-afgeleide xenografts bij knaagdieren en originele patiënttumoren20. Eerder hebben wij, en anderen, aangetoond dat GBM-cellen gekweekt in een 3D ECM die de mechanische en biochemische eigenschappen van hersenweefsel nabootst, medicijnresistentiefenotypen 10,21,22,23 kunnen behouden.
Interacties tussen hyaluronzuur (HA), een polysaccharide die overvloedig aanwezig is in de hersenen ECM en overexpressie in GBM-tumoren, en zijn CD44-receptor moduleren de verwerving van geneesmiddelresistentie in vitro 21,24,25,26,27. De opname van HA in zachte, 3D-culturen verhoogde bijvoorbeeld het vermogen van van de patiënt afgeleide GBM-cellen om therapeutische resistentie te verwerven. Deze mechano-responsiviteit was afhankelijk van HA-binding aan CD44-receptoren op GBM-cellen21. Bovendien versterkte integrinebinding aan RGD-dragende peptiden, opgenomen in 3D-cultuurmatrices, CD44-gemedieerde chemoresistantie op een stijfheidsafhankelijke manier21. Naast HA varieert de expressie van verschillende ECM-eiwitten, waarvan er vele RGD-regio’s bevatten, tussen normale hersenen en GBM-tumoren28. Een studie meldde bijvoorbeeld dat 28 verschillende ECM-eiwitten werden geupreguleerd in GBM-tumoren29. Binnen deze complexe tumormatrix micro-omgeving integreren kankercellen mechanische en biochemische signalen om een bepaald resistentiefenotype te produceren, dat afhankelijk is van relatief kleine verschillen (bijvoorbeeld minder dan een orde van grootte) in Young’s modulus of dichtheid van integrinebindende peptiden 28,29,30.
Het huidige protocol karakteriseert hoe tumorcellen unieke combinaties van matrixsignalen interpreteren en complexe, patiëntspecifieke matrixmicro-omgevingen identificeren die behandelingsresistentie bevorderen (figuur 1A). Een fotochemische methode voor het genereren van geminiaturiseerde, nauwkeurig afgestemde matrices voor 3D-cultuur biedt een grote, orthogonale variabele ruimte. Een op maat gemaakte reeks LED’s, gerund door een microcontroller, werd opgenomen in photocrosslink hydrogels binnen een 384-well plaatformaat om de automatisering en reproduceerbaarheid te vergroten. De intensiteit van de blootstelling varieerde goed om de micromechanische eigenschappen van de resulterende hydrogels te veranderen, zoals beoordeeld met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). Hoewel dit manuscript zich niet richt op het construeren van de verlichtingsarray zelf, worden een schakelschema (figuur 1B) en een onderdelenlijst (tabel met materialen) verstrekt als hulpmiddelen voor de reproductie van apparaten.
Dit rapport toont de snelle generatie van een reeks GBM-cellen gekweekt in unieke, 3D-micro-omgevingen waarin Young’s modulus (vier niveaus in een enkele orde van grootte) en integrine-bindende peptide-inhoud (afgeleid van vier verschillende ECM-eiwitten) orthogonaal werden gevarieerd. De aanpak werd vervolgens gebruikt om de relatieve bijdragen van hydrogelmechanica en ECM-specifieke integrine-betrokkenheid op de levensvatbaarheid en proliferatie van patiënt-afgeleide GBM-cellen te onderzoeken als ze resistentie verwerven tegen temozolomide (TMZ) chemotherapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige werk presenteert methoden om 3D, geminiaturiseerde culturen te genereren binnen HA-gebaseerde en tegelijkertijd matrixstijfheid en peptiden te veranderen die beschikbaar zijn voor integrine-betrokkenheid. Deze techniek maakt de systematische studie mogelijk van hoe matrixparameters cellulaire fenotypes beïnvloeden (bijvoorbeeld de levensvatbaarheid van kankercellen die worden blootgesteld aan chemotherapie) met een verhoogde doorvoer. Eerdere benaderingen, waaronder die hierin gepresenteerd, hebben de hydrog…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen specifiek Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore en Itay Solomon bedanken voor hun bijdragen aan eerdere iteraties van het fotogelatieschema. Cellijnen GS122 en GS304 werden genereus geleverd door David Nathanson. Alle figuren zijn gemaakt met BioRender.com. UCLA-kernfaciliteiten, de Molecular Screening Shared Resources en het Nano and Pico Characterization Laboratory waren instrumenteel voor het werk. Chen Chia-Chun werd ondersteund door het UCLA Eli en Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan werd ondersteund door een Tumor Cell Biology Training Program NIH Grant (T32 CA 009056).
Materials
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
References
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology’s trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochimie. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Recherche en cancérologie. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, 68-77 (2015).
- Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer’s law – Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
