Hydrogel-Arrays ermöglichen erhöhten Durchsatz für Screening-Effekte von Matrixkomponenten und Therapeutika in 3D-Tumormodellen

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine experimentelle Plattform zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer und biochemischer Hinweise auf chemotherapeutische Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen in 3D-matrixmimetischen Kulturen unter Verwendung eines maßgeschneiderten UV-Beleuchtungsgeräts, das die Hochdurchsatz-Photovernetzung von Hydrogelen mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften ermöglicht.

Abstract

Zell-Matrix-Interaktionen vermitteln komplexe physiologische Prozesse durch biochemische, mechanische und geometrische Hinweise und beeinflussen pathologische Veränderungen und therapeutische Reaktionen. Es wird erwartet, dass die Berücksichtigung von Matrixeffekten zu einem früheren Zeitpunkt in der Arzneimittelentwicklungspipeline die Wahrscheinlichkeit des klinischen Erfolgs neuartiger Therapeutika erhöhen wird. Es gibt auf Biomaterialien basierende Strategien, die spezifische Gewebemikroumgebungen in 3D-Zellkultur rekapitulieren, aber die Integration dieser mit den 2D-Kulturmethoden, die hauptsächlich für das Drogenscreening verwendet werden, war eine Herausforderung. Daher beschreibt das hier vorgestellte Protokoll die Entwicklung von Methoden für die 3D-Kultur in miniaturisierten Biomaterialmatrizen in einem Multi-Well-Plattenformat, um die Integration in bestehende Wirkstoff-Screening-Pipelines und konventionelle Assays für die Zelllebensfähigkeit zu erleichtern. Da von den Matrixmerkmalen, die für die Erhaltung klinisch relevanter Phänotypen in kultivierten Zellen entscheidend sind, ein hochgradig gewebe- und krankheitsspezifisches Screening erwartet wird, wird ein kombinatorisches Screening von Matrixparametern erforderlich sein, um geeignete Bedingungen für spezifische Anwendungen zu identifizieren. Die hier beschriebenen Methoden verwenden ein miniaturisiertes Kulturformat, um die Reaktionen von Krebszellen auf orthogonale Variation der Matrixmechanik und der Ligandenpräsentation zu bewerten. Insbesondere zeigt diese Studie die Verwendung dieser Plattform, um die Auswirkungen von Matrixparametern auf die Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen (GBM) auf die Chemotherapie zu untersuchen.

Introduction

Die erwarteten Kosten für die Entwicklung eines neuen Medikaments sind in den letzten zehn Jahren stetig gestiegen, mit über 1 Milliarde US-Dollar in aktuellen Schätzungen¹. Ein Teil dieser Kosten ist die hohe Ausfallrate von Medikamenten, die in klinische Studien aufgenommen werden. Etwa 12% der Arzneimittelkandidaten erhalten schließlich im Jahr 2019 die Zulassung der US-amerikanischen Food & Drug Administration (FDA). Viele Medikamente versagen in Phase I aufgrund unvorhergesehener Toxizität², während andere, die Sicherheitsstudien bestehen, aufgrund mangelnder Wirksamkeit^{scheitern können 3}. Diese Fluktuation aufgrund der Nichtwirksamkeit kann teilweise durch die Tatsache erklärt werden, dass Krebsmodelle, die während der Arzneimittelentwicklung verwendet werden, notorisch nicht prädiktiv für die klinische Wirksamkeit^{sind 4}.

Funktionelle Unterschiede zwischen In-vitro– und In-vivo-Modellen können auf die Entfernung von Krebszellen aus ihrer nativen Mikroumgebung zurückgeführt werden, einschließlich Nicht-Tumorzellen und der physikalischen ECM ^5,6. Häufig verwenden Forschungsgruppen kommerziell erhältliche Kulturmatrizen wie Matrigel (eine proteinhaltige Basalmembranmatrix, die von Maussarkomen abgeleitet ist), um kultivierten Tumorzellen eine 3D-Matrix-Mikroumgebung zur Verfügung zu stellen. Im Vergleich zur 2D-Kultur hat die 3D-Kultur in der Membranmatrix die klinische Relevanz der In-vitro-Ergebnisse verbessert ^7,8. Kulturbiomaterialien aus dezellularisierten Geweben, einschließlich der Membranmatrix, weisen jedoch typischerweise eine Variabilität von Charge zu Charge auf, die die Reproduzierbarkeit beeinträchtigen^{kann 9}. Darüber hinaus liefern Matrizen, die von Tumoren stammen, deren Gewebeursprung sich von den untersuchten unterscheidet, möglicherweise nicht die geeigneten physiologischen Hinweise¹⁰. Schließlich weisen Krebsarten mit hohem Grad an intratumoraler Heterogenität mikroökologische Merkmale auf, die auf einer Submikrometer-Größenskala variieren und deren Rekapitulation der Membranmatrix nicht abgestimmt werden^{kann 11}.

Das Glioblastom (GBM), ein gleichmäßig tödlicher Hirntumor mit einer medianen Überlebenszeit von etwa 15 Monaten, ist eine Krebserkrankung, bei der die Behandlungsentwicklung besonders schwierig war^12,13. Der derzeitige Behandlungsstandard für GBM besteht aus einer primären Tumorresektion, gefolgt von einer Strahlentherapie und einer anschließenden Chemotherapie mit Temozolomid (TMZ)¹⁴. Dennoch zeigen mehr als die Hälfte der klinischen GBM-Tumoren eine Behandlungsresistenz durch verschiedene Mechanismen^15,16,17. Die Vorhersage der Wirksamkeit eines Behandlungsschemas für einen einzelnen Patienten ist äußerst schwierig. Präklinische Standardmodelle, die zur Vorhersage individueller Ergebnisse verwendet werden, bestehen aus von Patienten abgeleiteten Tumorzellen, die orthotopisch in immungeschwächte Mäuse xenotransplantiert werden. Während von Patienten abgeleitete Xenotransplantate viele Aspekte klinischer GBM-Tumoren rekapitulieren können und für präklinische Modelle^{wertvoll sind 18}, sind sie von Natur aus teuer, geringer Durchsatz, zeitaufwendig und beinhalten ethische Bedenken¹⁹. Kulturen von Patientenzellen, auf 2D-Kunststoffoberflächen oder als Sphäroide vermeiden diese Probleme meistens. Während patientenabgeleitete Zellen genetische Aberrationen bewahren, waren ihre Kulturen in 2D oder als suspendierte Sphäroide weitgehend schlechte Darstellungen von patientenabgeleiteten Xenotransplantaten in Nagetieren und ursprünglichen Patiententumoren²⁰. Zuvor haben wir und andere gezeigt, dass GBM-Zellen, die in einem 3D-ECM kultiviert werden, das die mechanischen und biochemischen Eigenschaften des Hirngewebes nachahmt, die Phänotypen 10,21,22,23 der Arzneimittelresistenz erhalten können.

Wechselwirkungen zwischen Hyaluronsäure (HA), einem Polysaccharid, das im Gehirn-ECM reichlich vorhanden ist und in GBM-Tumoren überexprimiert wird, und seinem CD44-Rezeptor modulieren den Erwerb von Arzneimittelresistenzen in vitro 21,24,25,26,27. Zum Beispiel erhöhte die Einbeziehung von HA in weiche 3D-Kulturen die Fähigkeit von von Patienten abgeleiteten GBM-Zellen, therapeutische Resistenzen zu erlangen. Diese Mechano-Responsivität war abhängig von der HA-Bindung an CD44-Rezeptoren auf GBM-Zellen²¹. Zusätzlich verstärkte die Integrinbindung an RGD-tragende Peptide, die in 3D-Kulturmatrizen eingebaut wurden, CD44-vermittelte Chemoresistenz in einer steifigkeitsabhängigen Weise²¹. Über HA hinaus variiert die Expression mehrerer ECM-Proteine, von denen viele RGD-Regionen enthalten, zwischen normalen Hirn- und GBM-Tumoren²⁸. Zum Beispiel berichtete eine Studie, dass 28 verschiedene ECM-Proteine in GBM-Tumoren hochreguliert wurden²⁹. Innerhalb dieser komplexen Tumormatrix-Mikroumgebung integrieren Krebszellen mechanische und biochemische Hinweise, um einen bestimmten Resistenzphänotyp zu erhalten, der von relativ kleinen Unterschieden (z. B. weniger als einer Größenordnung) im Elastizitätsmodul oder der Dichte der integrinbindenden Peptide^28,29,30 abhängt.

Das vorliegende Protokoll charakterisiert, wie Tumorzellen einzigartige Kombinationen von Matrixhinweisen interpretieren und komplexe, patientenspezifische Matrixmikroumgebungen identifizieren, die die Behandlungsresistenz fördern (Abbildung 1A). Eine photochemische Methode zur Erzeugung miniaturisierter, präzise abgestimmter Matrizen für die 3D-Kultur bietet einen großen, orthogonalen variablen Raum. Ein speziell angefertigtes Array von LEDs, die von einem Mikrocontroller betrieben werden, wurde integriert, um Hydrogele innerhalb eines 384-Well-Plattenformats zu vernetzen, um die Automatisierung und Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Die Expositionsintensität wurde im gesamten Bohrloch variiert, um die mikromechanischen Eigenschaften der resultierenden Hydrogele zu verändern, wie sie mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) bewertet wurden. Während sich dieses Manuskript nicht auf die Konstruktion des Illuminationsarrays selbst konzentriert, werden ein Schaltplan (Abbildung 1B) und eine Stückliste (Table of Materials) als Hilfsmittel für die Gerätereproduktion bereitgestellt.

Dieser Bericht zeigt die schnelle Erzeugung einer Reihe von GBM-Zellen, die in einzigartigen 3D-Mikroumgebungen kultiviert wurden, in denen der Elastizitätsmodul (vier Ebenen über eine einzige Größenordnung) und der integrinbindende Peptidgehalt (abgeleitet von vier verschiedenen ECM-Proteinen) orthogonal variiert waren. Der Ansatz wurde dann verwendet, um die relativen Beiträge der Hydrogelmechanik und des ECM-spezifischen Integrin-Engagements auf die Lebensfähigkeit und Proliferation von patientenabgeleiteten GBM-Zellen zu untersuchen, wenn sie eine Resistenz gegen Temozolomid (TMZ) -Chemotherapie erwerben.

Protocol

Von Patienten abgeleitete GBM-Zelllinien (GS122 und GS304) wurden von Professor David Nathanson (unserem Mitarbeiter) zur Verfügung gestellt, der diese Linien im Rahmen eines vom UCLA Institutional Review Board genehmigten Protokolls (IRB # 10-000655) entwickelte. Zellen wurden de-identifiziert zur Verfügung gestellt, so dass die Zelllinien nicht mit den einzelnen Patienten in Verbindung gebracht werden konnten. 1. Herstellung von Hydrogellösung Bereiten Sie HEPES…

Representative Results

AFM-Messungen bestätigten die präzise Kontrolle der Hydrogelmechanik in Abhängigkeit von der UV-Bestrahlungsstärke (mW/cm2) während der Fotovernetzung mit einem speziell angefertigten, Arduino-gesteuerten LED-Array (Abbildung 2A). Die in diesem Protokoll verwendete Hydrogelformulierung ist in Tabelle 2 aufgeführt. Der Abstand der LEDs auf der mitgelieferten Schablone stimmt mit dem Abstand für jede andere Vertiefung einer 384-Well-Platte überein, wodurch d…

Discussion

Die aktuelle Arbeit präsentiert Methoden zur Erzeugung von 3D-, miniaturisierten Kulturen innerhalb von HA-basierten bei gleichzeitiger Veränderung der Matrixsteifigkeit und der für das Integrin-Engagement verfügbaren Peptide. Diese Technik ermöglicht die systematische Untersuchung, wie Matrixparameter zelluläre Phänotypen (z. B. die Lebensfähigkeit von Krebszellen, die einer Chemotherapie ausgesetzt sind) mit erhöhtem Durchsatz beeinflussen. Frühere Ansätze, einschließlich der hier vorgestellten, haben die H…

Materials

1.1 kOhm resistors, 6 W	Digikey	35601k1ft
1.7 mL microcentrifuge tube	Genesse Scientific	21-108
15 mL conical tube	Fisher Scientific	14-959-70C
365 nm LED	Digikey	ltpl-c034uvh365
384 well plate	Bio Greiner One	781090
40 µm cell strainer	MTC bio	C4040
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa)	Laysan Bio	4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs	Digikey	2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W	Digikey	erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa)	Jenkem Technology	A7025-1
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104500	cell dissociation  reagent
AFM Probes	Novascan		0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle
Arduino IDE	Arduino	1.8.19
Arduino Nano	Makerfire	Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CCK8	Abcam	ab228554
Centrifuge	Thermoscientific	sorvall legend xtr
CP100ST	Gilson	F148415	Pipette tips for positive displacement pipette
Cubis Semi-Micro Balance	Sartorius	MSA225S100DI
DMEM – F12 (50-50)	Life Technologies	11330057	1x
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)	Genesse Scientific	25-508
EGF	Peprotech	AF100-15	50 ng/mL
Ethanol, Anhydrous	Fisher Scientific	A405P	Add DI water to dilute to 70%
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials	Fisher Scientific	03-339-23C
Fisherbrand Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12B
G21 Supplement	Gemini Bio	400-160	50x
Hanks Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175095
HCl, ACS, 12M	Sigma Aldrich	S25838A	Add DI water to dilute to 1 M
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma Aldrich	H3149-100Ku	25 µg/mL
HEPES	Sigma Aldrich	H7006-100G
Hot Air Gun	Wagner	HT1000
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide	Genscript	Custom Order	GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95%	Sigma Aldrich	900889-1G
Magnetic stir plate	Thermo Scientific	SP194715
Microcentrifuge	Thermo Scientific	Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor	Gilson	FD10004	Positive displacement pipette
Micropipette Tips	Various Manufacturs		Various sizes
mLine micropipette	Sartorious
N-acetyl Cysteine	Sigma Aldrich	A7250-10G
Nanowizard 4	Bruker		AFM microscope
NaOH	Fisher Scientific	ss255-1	Add DI water to dilute to 1 M
Normoicin	Invivogen	ant-nr-1	500x
Osteopontin Peptide	Genscript	Custom Order	GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid	Drummond	4000102
Plain Microscope Slides	Globe Scientific	1301
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep	Grace Bio Labs	664201-A	Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet
Processing	Processing	3.5.4
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
Repeater Pipette Tips	Sartorious	30089430	1 mL sizes
RGD Peptide	Genscript		GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Serological Pipettes	Genesse Scientific	12-102,12-104	5,10 mL Pipettes
Solder Paste	Digikey	315-NC191LT15T5-ND
Solder Wire
Straight dissecting forceps	VWR Scientific	82027-408
Synergy H1 Plate Reader	Biotek
T-75 Cell Culture Treated Flask	Genesee Scientific	25-209
Temozolomide	Sigma Aldrich	T2577	Typically used from 10 µM to 100 µM
Tenascin-C Peptide	Genscript		GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified	Lifecore Biomedical	HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro	VWR	58948-375