ハイドロゲルアレイにより、3D腫瘍モデルにおけるマトリックス成分および治療薬の効果をスクリーニングするためのスループットの向上が可能
Summary
本プロトコールは、調整可能な機械的特徴を有するヒドロゲルのハイスループット光架橋を容易にするカスタムメイドのUV照明装置を使用して、3Dマトリックス模倣培養における患者由来の膠芽腫細胞の化学療法応答に対する機械的および生化学的手がかりの効果を評価するための実験プラットフォームを記載する。
Abstract
細胞-マトリックス相互作用は、生化学的、機械的、幾何学的手がかりを通じて複雑な生理学的プロセスを媒介し、病理学的変化および治療応答に影響を与える。医薬品開発パイプラインの早い段階でマトリックス効果を考慮することで、新規治療薬の臨床的成功の可能性が高まると予想されます。3D細胞培養における特定の組織微小環境を再現する生体材料ベースの戦略が存在するが、これらを主に薬物スクリーニングに使用される2D培養方法と統合することは困難であった。したがって、ここで提示されたプロトコルは、既存の薬物スクリーニングパイプラインおよび細胞生存率のための従来のアッセイとの統合を容易にするために、マルチウェルプレートフォーマットの小型化された生体材料マトリックス内で3D培養のための方法の開発を詳述する。培養細胞における臨床的に関連する表現型を保存するために重要なマトリックス特徴は、高度に組織特異的および疾患特異的であると予想されるため、マトリックスパラメータの組み合わせスクリーニングは、特定の用途に適した条件を特定するために必要であろう。ここで説明する方法は、微細化された培養フォーマットを使用して、マトリックス力学およびリガンド提示の直交変動に対する癌細胞応答を評価する。具体的には、この研究は、化学療法に対する患者由来の膠芽腫(GBM)細胞の応答に対するマトリックスパラメータの効果を調査するために、このプラットフォームを使用することを実証する。
Introduction
新薬開発の予想コストは過去10年間で着実に上昇しており、現在の見積もりでは10億ドルを超えています1。この費用の一部は、臨床試験に入る薬の高い失敗率です。医薬品候補の約12%が、最終的に2019年に米国食品医薬品局(FDA)から承認を得ています。多くの薬剤は、予期せぬ毒性2のために第I相で失敗しますが、安全性試験に合格した他の薬剤は有効性の欠如3のために失敗する可能性があります。非有効性によるこの消耗は、医薬品開発中に使用される癌モデルが臨床的有効性の予測がないことで悪名高いという事実によって部分的に説明することができる4。
インビトロモデルとインビボモデルとの間の機能的差異は、非腫瘍細胞および物理的ECMを含むそれらの天然微小環境から癌細胞を除去することに起因し得る5,6。一般に、研究グループは、マトリゲル(マウス肉腫に由来するタンパク質性基底膜マトリックス)などの市販の培養マトリックスを使用して、培養腫瘍細胞に3Dマトリックス微小環境を提供する。2D培養と比較して、膜マトリックス中の3D培養は、in vitro結果の臨床的関連性を改善した7、8。しかしながら、膜マトリックスを含む脱細胞化組織からの培養生体材料は、典型的には、再現性を損なう可能性のあるバッチ間変動性を示す9。さらに、研究されたものとは異なる組織起源を有する腫瘍に由来するマトリックスは、適切な生理学的手がかり10を提供しない可能性がある。最後に、腫瘍内不均一性の高いがんは、サブミクロンサイズのスケールで変化し、膜マトリックスを反復するように調整することができない微小環境的特徴を有する11。
膠芽腫(GBM)は、生存期間の中央値が約15ヶ月の均一致死性の脳腫瘍であり、治療法の開発が特に困難であった癌である12,13。GBMの現在の標準治療は、原発性腫瘍切除、続いて放射線療法、次いでテモゾロミド(TMZ)を用いた化学療法からなる14。しかしながら、臨床的GBM腫瘍の半分以上が様々な機序を通じて治療抵抗性を示す15、16、17。個々の患者に対する治療レジメンの有効性を予測することは非常に困難である。個々の転帰を予測するために使用される標準的な前臨床モデルは、免疫不全マウスに同所性異所性に異所的に移植された患者由来の腫瘍細胞からなる。患者由来の異種移植片は、臨床GBM腫瘍の多くの側面を再現することができ、前臨床モデル18にとって価値があるが、本質的に高価で、スループットが低く、時間がかかり、倫理的懸念を伴う19。患者由来の細胞を、2Dプラスチック表面上で、または回転楕円体として培養すると、ほとんどの場合、これらの問題を回避します。患者由来の細胞は遺伝的異常を保持しているが、2Dまたは浮遊スフェロイドとしてのそれらの培養物は、げっ歯類および元の患者腫瘍における患者由来異種移植片の表現がほとんど不十分であった20。これまで、私たちや他の人々は、脳組織の機械的および生化学的特性を模倣する3D ECMで培養されたGBM細胞が薬剤耐性表現型を維持できることを示しました10,21,22,23。
脳ECMに豊富に存在し、GBM腫瘍において過剰発現される多糖であるヒアルロン酸(HA)とそのCD44受容体との間の相互作用は、インビトロでの薬物耐性の獲得を調節する21、24、25、26、27。例えば、軟質3D培養物内にHAを含めることで、患者由来のGBM細胞が治療抵抗性を獲得する能力が増加した。このメカノ応答性は、GBM細胞上のCD44受容体へのHA結合に依存していた21。さらに、RGD担持ペプチドへのインテグリン結合は、3D培養マトリックスに組み込まれ、CD44媒介性化学抵抗性を剛性依存的に増幅した21。HAを超えて、いくつかのECMタンパク質の発現は、多くはRGD領域を含み、正常な脳腫瘍とGBM腫瘍との間で変化する28。例えば、ある研究では、GBM腫瘍において28種類のECMタンパク質がアップレギュレートされたことが報告されています29。この複雑な腫瘍マトリックス微小環境内で、癌細胞は、機械的および生化学的手がかりを統合して、インテグリン結合ペプチドのヤング率または密度における比較的小さな差(例えば、一桁未満)に依存する特定の耐性表現型を生じる28、29、30。
本プロトコールは、腫瘍細胞がマトリックス合図のユニークな組み合わせを解釈し、治療抵抗性を促進する複雑で患者固有のマトリックス微小環境を特定する方法を特徴付けるものです(図1A)。3D培養用の小型で正確に調整された行列を生成するための光化学的方法は、大きくて直交する可変空間を提供する。マイクロコントローラによって実行されるカスタムメイドのLEDアレイは、自動化と再現性を高めるために、384ウェルプレートフォーマット内のヒドロゲルを光架橋するために組み込まれました。露光強度は、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて評価されるように、得られたヒドロゲルのマイクロ機械的特性を変化させるためにウェルにわたって変化させた。本稿では照明アレイ自体の構築には焦点を当てていませんが、デバイスの再生の補助として回路図(図1B)と部品リスト(材料表)を提供しています。
この報告は、ヤング率(1桁の4つのレベル)とインテグリン結合ペプチド含量(4つの異なるECMタンパク質に由来する)が直交して変化したユニークな3D微小環境で培養された一連のGBM細胞の迅速な生成を実証している。次に、このアプローチを使用して、患者由来GBM細胞がテモゾロミド(TMZ)化学療法に対する耐性を獲得する際の生存率および増殖に対するヒドロゲル力学およびECM特異的インテグリン関与の相対的寄与を調査した。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在の研究は、HAベース内で3Dの小型化された培養物を生成すると同時に、マトリックスの剛性とインテグリンエンゲージメントに利用可能なペプチドを変更する方法を提示しています。この技術は、マトリックスパラメータが細胞表現型(例えば、化学療法に曝露された癌細胞の生存率)にどのように影響するかを、より高いスループットで体系的に研究することを可能にする。本明細書に提?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Carolyn Kim、Amelia Lao、Ryan Stoutamore、Itay Solomonがフォトジェレーションスキームの初期の反復に貢献したことを特に認めたいと思います。細胞株GS122およびGS304は、David Nathansonによって寛大に提供された。すべての図は BioRender.com で作成されました。UCLAの中核施設、分子スクリーニング共有リソース、ナノおよびピコキャラクタリゼーション研究所は、この研究に役立った。Chen Chia-Chunは、UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Programの支援を受けました。Grigor Varuzhanyanは、Tumor Cell Biology Training Program NIH Grant(T32 CA 009056)の支援を受けました。
Materials
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
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