하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.
Summary
본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.
Abstract
세포 – 매트릭스 상호 작용은 생화학적, 기계적, 기하학적 단서를 통해 복잡한 생리 학적 과정을 중재하여 병리학 적 변화와 치료 반응에 영향을 미칩니다. 약물 개발 파이프라인 초기에 매트릭스 효과를 고려하면 새로운 치료제의 임상 성공 가능성이 높아질 것으로 예상된다. 3D 세포 배양에서 특정 조직 미세 환경을 재순환시키는 생체 재료 기반 전략은 존재하지만 이를 약물 스크리닝에 주로 사용되는 2D 배양 방법과 통합하는 것은 어려운 과제였습니다. 따라서, 여기에 제시된 프로토콜은 세포 생존을 위한 기존 약물 스크리닝 파이프라인 및 종래의 분석과의 통합을 용이하게 하기 위해 다중 웰 플레이트 포맷으로 소형화된 생체재료 매트릭스 내에서 3D 배양을 위한 방법의 개발을 상세히 기술한다. 배양된 세포에서 임상적으로 관련된 표현형을 보존하는데 중요한 매트릭스 특징이 고도로 조직- 및 질병-특이적일 것으로 예상되기 때문에, 매트릭스 파라미터의 조합 스크리닝은 특정 적용을 위한 적절한 조건을 식별하기 위해 필요할 것이다. 여기에 설명된 방법들은 매트릭스 역학 및 리간드 프리젠테이션의 직교 변이에 대한 암 세포 반응을 평가하기 위해 소형화된 배양 포맷을 사용한다. 구체적으로, 본 연구는 화학요법에 대한 환자 유래 교모세포종 (GBM) 세포의 반응에 대한 매트릭스 파라미터의 효과를 조사하기 위해 이 플랫폼의 사용을 입증한다.
Introduction
신약 개발의 예상 비용은 지난 10 년 동안 꾸준히 상승했으며 현재 추정치에서 10 억 달러 이상이었습니다 1. 이 비용의 일부는 임상 시험에 들어가는 약물의 높은 실패율입니다. 약물 후보의 약 12 %는 궁극적으로 2019 년 미국 (미국) 식품 의약품 안전청 (FDA)의 승인을 얻습니다. 많은 약물이 예기치 않은 독성2로 인해 I 단계에서 실패하는 반면, 안전성 시험을 통과 한 다른 약물은 효능 부족으로 인해 실패 할 수 있습니다3. 비효능으로 인한 이러한 감소는 약물 개발 동안 사용되는 암 모델이 임상적 효능의 비예측으로 악명 높다는 사실에 의해 부분적으로 설명될 수 있다4.
시험관내 및 생체내 모델 사이의 기능적 불균형은 비종양 세포 및 물리적 ECM 5,6을 포함하는 그들의 천연 미세환경으로부터 암 세포를 제거하는 것에 기인할 수 있다. 일반적으로 연구 그룹은 Matrigel (마우스 육종에서 유래 한 단백질성 기저막 매트릭스)과 같은 상업적으로 이용 가능한 배양 매트릭스를 사용하여 배양 된 종양 세포에 3D 매트릭스 미세 환경을 제공합니다. 2D 배양과 비교하여, 막 매트릭스에서의 3D 배양은 시험관내 결과 7,8의 임상적 관련성을 개선시켰다. 그러나, 막 매트릭스를 포함하는 탈세포화된 조직으로부터의 배양 생체재료는, 전형적으로 재현성9를 손상시킬 수 있는 배치-배치-배치-배치 가변성을 나타낸다. 더욱이, 연구된 것들로부터 상이한 조직 기원을 갖는 종양으로부터 유래된 매트릭스는 적절한 생리학적 단서(10)를 제공하지 않을 수 있다. 마지막으로, 종양내 이질성이 높은 암은 서브마이크론 크기 규모에 따라 다양하고 막 매트릭스가11을 재조정하도록 조정될 수 없는 미세환경적 특징을 갖는다.
교모세포종(GBM)은 약 15개월의 중간 생존 시간을 갖는 균일하게 치명적인 뇌종양으로, 치료 개발이 특히 어려웠던 암이다12,13. GBM에 대한 현재의 치료 표준은 원발성 종양 절제술, 방사선 요법, 그리고 테모졸로마이드 (TMZ)14를 사용한 화학 요법으로 구성됩니다. 그러나 임상 GBM 종양의 절반 이상이 다양한 메커니즘 15,16,17을 통해 치료 저항성을 나타냅니다. 개별 환자에 대한 치료 요법의 효능을 예측하는 것은 매우 어렵습니다. 개별 결과를 예측하는 데 사용되는 표준 전임상 모델은 면역저하된 마우스에 정형외적으로 이종이식편된 환자 유래 종양 세포로 구성된다. 환자 유래 이종이식편은 임상 GBM 종양의 여러 측면을 재검토할 수 있고 전임상 모델(18)에 가치가 있지만, 본질적으로 비용이 많이 들고, 처리량이 낮고, 시간이 많이 걸리며, 윤리적 관심사19를 수반한다. 환자 유래 세포의 배양, 2D 플라스틱 표면 또는 구상체는 대부분 이러한 문제를 피합니다. 환자 유래 세포는 유전적 수차를 보존하는 반면, 2D 또는 현탁된 구상체로서의 그들의 배양은 설치류 및 원래 환자 종양(20)에서 환자 유래 이종이식편의 표현이 대체로 불량하였다. 이전에 우리와 다른 사람들은 뇌 조직의 기계적 및 생화학 적 특성을 모방 한 3D ECM에서 배양 된 GBM 세포가 약물 내성 표현형10,21,22,23을 보존 할 수 있음을 보여주었습니다.
뇌 ECM에 풍부하며 GBM 종양에서 과발현되는 다당류인 히알루론산(HA)과 이의 CD44 수용체 사이의 상호작용은 시험관내 약물 내성의 획득을 조절한다 21,24,25,26,27. 예를 들어, 연질, 3D 배양물 내에 HA를 포함시키는 것은 치료 내성을 획득하는 환자 유래 GBM 세포의 능력을 증가시켰다. 이러한 메카노-반응성은 GBM 세포21 상의 CD44 수용체에 대한 HA 결합에 의존하였다. 추가적으로, RGD 함유 펩티드에 대한 인테그린 결합은, 3D 배양 매트릭스에 혼입되어, 강성 의존적 방식으로 CD44 매개된 화학저항성을 증폭시켰다21. HA 이외에도, RGD 영역을 함유하는 많은 ECM 단백질의 발현은 정상 뇌와 GBM 종양(28) 사이에서 다양하다. 예를 들어, 한 연구는 GBM 종양29에서 28 개의 별개의 ECM 단백질이 상향 조절되었다고보고했습니다. 이러한 복잡한 종양 매트릭스 미세환경 내에서, 암 세포는 기계적 및 생화학적 단서를 통합하여 특정 내성 표현형을 산출하는데, 이는 인테그린 결합 펩티드28,29,30의 영 모듈러스 또는 밀도에서 상대적으로 작은 차이(예를 들어, 크기 차수 미만)에 의존한다.
본 프로토콜은 종양 세포가 매트릭스 단서의 고유한 조합을 해석하고 치료 저항성을 촉진하는 복잡하고 환자 특정 매트릭스 미세환경을 식별하는 방법을 특성화합니다(그림 1A). 3D 배양을 위해 소형화되고 정밀하게 조정된 매트릭스를 생성하는 광화학적 방법은 크고 직교하는 가변 공간을 제공합니다. 마이크로 컨트롤러에 의해 실행되는 맞춤형 LED 어레이가 384웰 플레이트 형식 내의 포토크로스링크 하이드로젤에 통합되어 자동화 및 재현성을 높였습니다. 노출 강도는 원자력 현미경 (AFM)을 사용하여 평가된 바와 같이 생성된 하이드로젤의 마이크로기계적 특성을 변경시키기 위해 웰에 걸쳐 다양하였다. 이 원고는 조명 어레이 자체를 구성하는 데 초점을 맞추지는 않지만 회로도(그림 1B) 및 부품 목록(재료 표)은 장치 재생을 위한 보조 도구로 제공됩니다.
이 보고서는 영 모듈러스 (단일 크기의 순서에 걸쳐 네 가지 수준)와 인테그린 결합 펩티드 함량 (네 가지 ECM 단백질에서 유래)이 직교적으로 다양한 독특한 3D 미세 환경에서 배양 된 GBM 세포 어레이의 신속한 생성을 보여줍니다. 이 접근법은 테모졸로마이드 (TMZ) 화학요법에 대한 내성을 획득함에 따라 환자 유래 GBM 세포의 생존 가능성 및 증식에 대한 하이드로겔 역학 및 ECM 특이적 인테그린 결합의 상대적 기여를 조사하기 위해 사용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재의 연구는 HA 기반 내에서 3D, 소형화 된 배양물을 생성하는 동시에 인테그린 결합에 사용할 수있는 매트릭스 강성과 펩타이드를 변경하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 매트릭스 파라미터가 증가된 처리량으로 세포 표현형(예를 들어, 화학요법에 노출된 암 세포의 생존력)에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 체계적인 연구를 가능하게 한다. 본원에 제시된 것을 포함하는 이전의 접근법들은 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore, Itay Solomon이 포토겔화 계획의 초기 반복에 기여한 것에 대해 구체적으로 인정하고 싶습니다. 세포주 GS122 및 GS304는 데이비드 네이선슨에 의해 관대하게 제공되었다. 모든 인물은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. UCLA 핵심 시설, 분자 스크리닝 공유 자원 및 나노 및 피코 특성화 실험실이이 작업에 도움이되었습니다. Chen Chia-Chun은 UCLA Eli와 Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program의 지원을 받았습니다. Grigor Varuzhanyan은 종양 세포 생물학 교육 프로그램 NIH 그랜트 (T32 CA 009056)의 지원을 받았다.
Materials
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
References
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology’s trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochimie. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Recherche en cancérologie. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, 68-77 (2015).
- Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer’s law – Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
