Hydrogel arrayer muliggjør økt gjennomstrømning for screeningeffekter av matrisekomponenter og terapeutiske stoffer i 3D tumormodeller
Summary
Den nåværende protokollen beskriver en eksperimentell plattform for å vurdere effekten av mekaniske og biokjemiske signaler på kjemoterapeutiske responser av pasientavledede glioblastomceller i 3D-matrise-mimetiske kulturer ved hjelp av en skreddersydd UV-belysningsenhet som letter høygjennomstrømning fotocrosslinking av hydrogeler med justerbare mekaniske egenskaper.
Abstract
Cellematriseinteraksjoner formidler komplekse fysiologiske prosesser gjennom biokjemiske, mekaniske og geometriske signaler, som påvirker patologiske endringer og terapeutiske responser. Å ta høyde for matriseeffekter tidligere i legemiddelutviklingsrørledningen forventes å øke sannsynligheten for klinisk suksess for nye terapeutiske behandlinger. Biomaterialebaserte strategier som rekapitlerer spesifikke vevsmikromiljøet i 3D-cellekulturen eksisterer, men det har vært utfordrende å integrere disse med 2D-kulturmetodene som primært brukes til legemiddelscreening. Dermed beskriver protokollen her utviklingen av metoder for 3D-kultur innen miniatyriserte biomaterialer i et flerbrønnsplateformat for å lette integrasjonen med eksisterende legemiddelscreeningsrørledninger og konvensjonelle analyser for celle levedyktighet. Siden matrisefunksjonene som er kritiske for å bevare klinisk relevante fenotyper i dyrkede celler forventes å være svært vevs- og sykdomsspesifikke, vil kombinatorisk screening av matriseparametere være nødvendig for å identifisere passende forhold for spesifikke applikasjoner. Metodene beskrevet her bruker et miniatyrisert kulturformat for å vurdere kreftcelleresponser på ortogonal variasjon av matrisemekanikk og ligandpresentasjon. Spesielt demonstrerer denne studien bruken av denne plattformen for å undersøke effekten av matriseparametere på svarene fra pasientavledede glioblastomceller (GBM) til kjemoterapi.
Introduction
De forventede kostnadene ved å utvikle et nytt legemiddel har økt jevnt det siste tiåret, med over 1 milliard dollar i dagens anslag1. En del av denne utgiften er den høye sviktraten for legemidler som går inn i kliniske studier. Omtrent 12% av narkotikakandidatene får til slutt godkjenning fra USA (US) Food &Drug Administration (FDA) i 2019. Mange legemidler svikter i fase I på grunn av uforutsett toksisitet2, mens andre som består sikkerhetsforsøk kan mislykkes på grunn av mangel på effekt3. Denne utmattelsen på grunn av ikke-effekt kan delvis forklares med at kreftmodeller som brukes under legemiddelutvikling er notorisk ikke-prediktive for klinisk effekt4.
Funksjonelle forskjeller mellom in vitro– og in vivo-modeller kan tilskrives fjerning av kreftceller fra deres opprinnelige mikromiljø, inkludert ikke-tumorceller og den fysiske ECM 5,6. Vanligvis bruker forskningsgrupper kommersielt tilgjengelige kulturmatriser, for eksempel Matrigel (en proteinholdig kjellermembranmatrise avledet fra mus sarkomer) for å gi kultiverte tumorceller et 3D-matrisemikromiljø. Sammenlignet med 2D-kultur har 3D-kultur i membranmatrise forbedret den kliniske relevansen av in vitro-resultater 7,8. Imidlertid viser kulturbiomaterialer fra decellularisert vev, inkludert membranmatrisen, vanligvis batch-til-batch variasjon som kan kompromittere reproduserbarhet9. Videre kan matriser avledet fra svulster med forskjellig vevsopprinnelse fra de studerte ikke gi de riktige fysiologiske signalene10. Til slutt har kreft med høye grader av intratumoral heterogenitet mikromiljøegenskaper som varierer på en submikronstørrelsesskala, og som membranmatrisen ikke kan justeres for å rekapitulere11.
Glioblastom (GBM), en jevnt dødelig hjernesvulst med en median overlevelsestid på ca. 15 måneder, er en kreft som behandlingsutviklingen har vært spesielt vanskelig for 12,13. Den nåværende standarden for omsorg for GBM består av primær tumor reseksjon, etterfulgt av strålebehandling, og deretter kjemoterapi ved hjelp av temozolomid (TMZ)14. Likevel viser mer enn halvparten av kliniske GBM-svulster behandlingsresistens gjennom ulike mekanismer 15,16,17. Det er ekstremt vanskelig å forutsi effekten av et behandlingsregime for en enkelt pasient. Standard prekliniske modeller som brukes til å forutsi individuelle resultater består av pasientavledede tumorceller xenograftert ortopisk til immunkompromitterte mus. Mens pasientavledede xenografter kan rekapitulere mange aspekter av kliniske GBM-svulster og er verdifulle for prekliniske modeller18, er de iboende dyre, lave gjennomstrømning, tidkrevende og involverer etiske bekymringer19. Kulturer av pasientavledede celler, på 2D-plastoverflater eller som sfæroider, unngår for det meste disse problemene. Mens pasientavledede celler bevarer genetiske avvik, har deres kulturer i 2D eller som suspenderte sfæroider i stor grad vært dårlige representasjoner av pasientavledede xenografter hos gnagere og originale pasientsvulster20. Tidligere har vi, og andre, vist at GBM-celler dyrket i en 3D ECM som etterligner de mekaniske og biokjemiske egenskapene til hjernevev, kan bevare legemiddelresistensfenotyper 10,21,22,23.
Interaksjoner mellom hyaluronsyre (HA), en polysakkarid rikelig i hjernen ECM og overekspressert i GBM svulster, og dens CD44 reseptor modulere oppkjøpet av narkotikaresistens in vitro 21,24,25,26,27. For eksempel økte inkluderingen av HA i myke 3D-kulturer evnen til pasientavledede GBM-celler til å oppnå terapeutisk motstand. Denne mekano-ansvarligheten var avhengig av HA-binding til CD44-reseptorer på GBM-cellene21. I tillegg integrin binding til RGD-bærende peptider, innlemmet i 3D kultur matriser, forsterket CD44-mediert chemoresistance i en stivhet-avhengig måte21. Utover HA varierer uttrykket for flere ECM-proteiner, mange som inneholder RGD-regioner, mellom normal hjerne og GBM-svulster28. For eksempel rapporterte en studie at 28 forskjellige ECM-proteiner ble oppregulert i GBM-svulster29. Innenfor dette komplekse tumormatrisemikromiljøet integrerer kreftceller mekaniske og biokjemiske signaler for å gi en bestemt resistensfenotype, som avhenger av relativt små forskjeller (f.eks. mindre enn en størrelsesorden) i Youngs modulus eller tetthet av integrinbindende peptider 28,29,30.
Den nåværende protokollen karakteriserer hvordan tumorceller tolker unike kombinasjoner av matrisesignaler og identifiserer komplekse, pasientspesifikke matrisemikromiljøet som fremmer behandlingsresistens (figur 1A). En fotokjemisk metode for å generere miniatyriserte, nøyaktig innstilte matriser for 3D-kultur gir et stort, ortogonalt variabelt rom. Et spesialbygd utvalg av lysdioder, drevet av en mikrokontroller, ble innlemmet i photocrosslink hydrogeler i et 384-brønns plateformat for å øke automatisering og reproduserbarhet. Eksponeringsintensiteten var variert på tvers av brønner for å endre mikromekaniske egenskaper til resulterende hydrogeler, vurdert ved hjelp av atomkraftmikroskopi (AFM). Selv om dette manuskriptet ikke fokuserer på å konstruere selve belysningsrekken, leveres et kretsdiagram (figur 1B) og deleliste (materialliste) som hjelpemidler for enhetsgjengivelse.
Denne rapporten demonstrerer den raske generasjonen av en rekke GBM-celler dyrket i unike 3D-mikromiljø der Youngs modulus (fire nivåer over en enkelt størrelsesorden) og integrinbindende peptidinnhold (avledet fra fire forskjellige ECM-proteiner) var variert ortogonalt. Tilnærmingen ble deretter brukt til å undersøke de relative bidragene fra hydrogelmekanikk og ECM-spesifikt integrinsk engasjement om levedyktighet og spredning av pasientavledede GBM-celler når de får resistens mot temozolomid (TMZ) kjemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det nåværende arbeidet presenterer metoder for å generere 3D, miniatyriserte kulturer innen HA-basert samtidig som matrisestivhet og peptider er tilgjengelige for integrinsk engasjement. Denne teknikken muliggjør systematisk studie av hvordan matriseparametere påvirker cellulære fenotyper (f.eks. levedyktigheten til kreftceller utsatt for kjemoterapi) med økt gjennomstrømning. Tidligere tilnærminger, inkludert det som presenteres heri, har justert hydrogelstivheten ved å variere prosentandelen totalpolymer i de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å spesifikt anerkjenne Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore og Itay Solomon for deres bidrag til tidligere iterasjoner av fotogelasjonsordningen. Cellelinjene GS122 og GS304 ble sjenerøst levert av David Nathanson. Alle tallene ble opprettet med BioRender.com. UCLA kjernefasiliteter, Molecular Screening Shared Resources og Nano and Pico Characterization Laboratory var medvirkende til arbeidet. Chen Chia-Chun ble støttet av UCLA Eli og Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan ble støttet av tumorcellebiologiopplæringsprogram NIH Grant (T32 CA 009056).
Materials
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
References
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology’s trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochimie. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Recherche en cancérologie. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, 68-77 (2015).
- Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer’s law – Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
