梳理自然杀伤细胞和伤害感受神经元之间的相互作用
Summary
伤害感受器神经元和NK细胞在炎症环境中积极相互作用。共同文化方法可以研究这种相互作用。
Abstract
体感神经元已经进化到可以检测有害刺激并激活防御反射。通过共享通信方式，伤害感受器神经元还通过控制免疫系统的活动来调整宿主的防御。这些系统之间的通信大多是自适应的，有助于保护体内平衡，它也可以导致或促进慢性疾病的发作。这两个系统共同进化以允许这种局部相互作用，如在原发性和继发性淋巴组织和粘膜中发现的那样。最近的研究表明，伤害感受器直接检测和响应外来抗原、免疫细胞来源的细胞因子和微生物。
伤害感受器激活不仅会导致疼痛超敏反应和瘙痒，而且会降低伤害感受器的发射阈值，导致神经肽的局部释放。由伤害感受器的外周末端产生和释放的肽可以阻断淋巴细胞的趋化性和极化，控制炎症的定位、持续时间和类型。最近的证据表明，感觉神经元通过细胞间接触与先天免疫细胞相互作用，例如， 与 自然杀伤（NK）细胞上的2D组（NKG2D）受体接触。
鉴于NK细胞表达各种伤害感受器产生的介质的同源受体，可以想象伤害感受器使用神经肽来控制NK细胞的活性。在这里，我们设计了一种共培养方法来研究培养皿中的伤害感受器神经元-NK细胞相互作用。使用这种方法，我们发现腰椎伤害感受器神经元降低NK细胞因子表达。总体而言，这种还原论方法可能有助于研究肿瘤支配神经元如何控制NK细胞的抗癌功能以及NK细胞如何控制受损神经元的消除。
Introduction
感觉神经元的细胞体起源于背根神经节（DRG）。DRG位于周围神经系统（PNS）中，位于脊髓背角和周围神经末梢之间。DRG神经元的伪单极性质允许将信息从支配靶组织的外周分支传递到中枢分支，中央分支将体感信息传递到脊髓1。使用专门的离子通道受体，一级神经元感知病原体、过敏原和污染物带来的威胁2，导致阳离子（Na+、Ca2+）的流入和动作电位3，4，5 的产生。
这些神经元还将反潜动作电位发送到发生初始危险感知的外围，这导致神经肽1，4的局部释放。因此，伤害感受器神经元作为一种保护机制，提醒宿主注意环境危险4，5，6，7。
为了与二级神经元通信，伤害感受器释放各种神经递质（例如谷氨酸）和神经肽（例如降钙素基因相关肽（CGRP），P物质（SP）和血管活性肠肽（VIP））6，7。这些肽作用于毛细血管，促进血浆外渗、水肿以及免疫细胞的局部流入和调节2，4，7。
体感和免疫系统利用由细胞因子和神经肽及其各自的同源受体组成的共享通信系统4。虽然这种双向通信有助于防止危险并保持体内平衡，但它也有助于疾病病理生理学4。
NK细胞被归类为先天淋巴细胞，专门用于消除病毒感染的细胞。NK细胞功能由刺激性和抑制性受体的平衡控制，包括激活受体NKG2D8。NKG2D的内源性配体，维甲酸早期诱导1（RAE1），由经历肿瘤发生和感染等应激的细胞表达8，9。
最近的研究表明，周围神经损伤驱动感觉神经元表达适应不良的分子，如stathmin 2（STMN2）和RAE1。因此， 通过 细胞间接触，表达NKG2D的NK细胞通过与表达RAE1的神经元相互作用而被激活。反过来，NK细胞能够消除通常与神经损伤相关的损伤伤害感受器神经元和钝性疼痛超敏反应10。除了NKG2D-RAE1轴外，NK细胞还表达各种伤害感受器产生的介质的同源受体。因此，这些介质有可能调节NK细胞活性。本文提出了一种共培养方法来研究伤害感受器神经元-NK细胞相互作用的生物学。这种方法将有助于促进对伤害感受神经元如何调节先天免疫细胞对损伤、感染或恶性肿瘤的反应的理解。
Protocol
Representative Results
Discussion
Davies等人11 发现受伤的神经元上调RAE1。 通过 细胞间接触，表达NKG2D的NK细胞能够识别和消除RAE1+ 神经元，这反过来又限制了慢性疼痛11。鉴于NK细胞也表达各种神经肽受体，并且这些神经肽以其免疫调节能力而闻名，因此在 体外研究NK细胞与伤害感受器神经元之间的相互作用似乎越来越重要。在这里，我们设计了一个简单的共培养方案，允…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了研究基金新前沿（NFRFE201901326）、加拿大卫生研究院（162211，461274，461275），加拿大创新基金会（37439），加拿大研究主席计划（950-231859），加拿大自然科学和工程研究委员会（RGPIN-2019-06824）和魁北克自然与技术研究基金会（253380）的支持。
Materials
| Anti-mouse CD16/32 | Jackson Laboratory | Cat no: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Cat no: 009669 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade | World Precision Instruments | Cat no: 504167 | |
| BV421 anti-mouse NK-1.1 | Fisher Scientific | Cat no: 12430112 | |
| Cell strainer (50 μm) | Fisher Scientific | Cat no: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat no: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/fl | Fisher Scientific | Cat no: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat no: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat no: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | Sigma | Cat no: CLS2595 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | Cat no: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | Cat no: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat no: L2020 | |
| Flat bottom 96-well plate | Sigma | Cat no: 03690 | |
| Glass Pasteur pipette | Sigma | Cat no: 470236-274 | |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) | VWR | Cat no: 02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Cat no: 03-50/31 | |
| L-Glutamine | Gibco | Cat no: A14867-01 | |
| Mouse recombinant IL-15 | Gibco | Cat no: 22400-089 | |
| Mouse recombinant IL-2 | Gibco | Cat no: 21103-049 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Life Technologies | Cat no: 13257-019 | |
| Neurobasal media | PeproTech | Cat no: 450-51-10 | |
| PE anti-mouse GM-CSF | PeproTech | Cat no: 212-12 | |
| Penicillin and Streptomycin | PeproTech | Cat no: 210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | Cat no: 19855 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biolegend | Cat no: 108732 | Clone PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Cat no: 137606 | Clone 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Cat no: 505406 | Clone MP1-22E9 |
| Tweezers and dissection tools. | Biolegend | Cat no: 65-0865-14 | |
| U-Shaped-bottom 96-well plate | Biolegend | Cat no: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
References
- Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
- Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
- Binshtok, A. M., et al. Nociceptors are interleukin-1beta sensors. Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).
- Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. Neuro-immune regulation of mucosal physiology. Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).
- Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
- Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
- Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
- Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
- Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333 (2021).
- Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
- Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
- Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).
