성상 세포 영토 부피 분석 및 두꺼운 자유 부유 조직 절편의 타일링
Summary
이 프로토콜은 마우스 뇌의 자유 부유 조직 절편을 절편화, 염색 및 이미징하는 방법을 설명하고, 이어서 성상세포 영역 부피 및 성상세포 영역 중첩 또는 타일링의 분석에 대한 상세한 설명을 설명한다.
Abstract
성상세포는 뇌 내의 거의 모든 유형의 세포 및 구조와 상호 작용할 수있게 해주는 놀라운 수준의 형태 학적 복잡성을 가지고 있습니다. 이러한 상호 작용을 통해 성상 세포는 시냅스 형성, 신경 전달 및 이온 항상성을 포함한 많은 중요한 뇌 기능을 적극적으로 조절합니다. 설치류 뇌에서 성상 세포는 출생 후 처음 세 주 동안 크기와 복잡성이 증가하고 뇌를 타일링하기 위해 뚜렷하고 겹치지 않는 영역을 확립합니다. 이 프로토콜은 마우스 뇌에서 자유 부유 조직 절편을 사용하여 성상 세포 영역 부피 및 성상 세포 타일링을 분석하기위한 확립 된 방법을 제공합니다. 먼저, 이 프로토콜은 자유 부유 조직 절편의 조직 수집, 냉동 절제술 및 면역염색을 위한 단계를 기술한다. 둘째,이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 성상 세포 영토 부피 및 영토 중첩 부피의 이미지 획득 및 분석을 설명합니다. 마지막으로,이 원고는 이러한 방법의 장점, 중요한 고려 사항, 일반적인 함정 및 한계에 대해 논의합니다. 이 프로토콜은 성상세포의 희소 또는 모자이크 형광 표지를 가진 뇌 조직을 필요로 하며, 일반적인 실험실 장비, 공초점 현미경 및 상업적으로 이용가능한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 사용하도록 설계되었다.
Introduction
성상세포는 뇌에서 많은 중요한 기능을 수행하는 정교하게 분지된 세포이다1. 마우스 피질에서, 방사상 신경교세포 줄기 세포는 후기 배아 및 초기 산후 단계2 동안 성상세포를 발생시킨다. 출생 후 처음 세 주 동안, 성상세포는 크기와 복잡성이 증가하여 시냅스와 직접 상호 작용하는 수천 개의 미세한 가지를 개발합니다1. 동시에, 성상세포는 이웃하는 성상세포와 상호작용하여 갭 접합 채널(4)을 통한 통신을 유지하면서 뇌(3)를 타일링하기 위해 이산적이고 겹치지 않는 영역을 구축한다. 성상세포 형태학 및 조직은 모욕 또는 상해5 후 많은 질병 상태에서 붕괴되며, 이는 적절한 뇌 기능을 위한 이러한 과정의 중요성을 나타낸다. 정상적인 발달, 노화 및 질병 동안 성상 세포 형태 학적 특성을 분석하면 성상 세포 생물학 및 생리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한, 유전자 조작에 따른 성상세포 형태학의 분석은 성상세포 형태학적 복잡성의 확립 및 유지를 지배하는 세포 및 분자 메커니즘을 식별하기 위한 귀중한 도구이다.
마우스 뇌에서 성상세포 형태학의 분석은 성상세포 분지화 복잡성과 성상세포 타일링 둘 다에 의해 복잡하다. 중간 필라멘트 신경교세포 세동 산성 단백질 (GFAP)을 성상세포 특이적 마커로서 사용한 항체 염색은 주요 분지만을 포획하고, 성상세포 형태학적 복잡성을 크게 과소평가한다1. 글루타메이트 수송체 1 (GLT-1; slc1a2), 글루타민 신테타제 또는 S100β와 같은 다른 세포 특이적 마커는 성상세포 분지6을 표지하는 더 나은 일을 수행하지만, 새로운 문제를 야기한다. 성상 세포 영역은 크게 겹치지 않지만 주변 가장자리에는 약간의 겹침이 존재합니다. 분지화의 복잡성 때문에, 이웃 성상세포가 같은 색으로 라벨링될 때, 한 성상세포가 끝나고 다른 성상세포가 시작되는 곳을 구별하는 것은 불가능하다. 내인성 형광 단백질로 성상세포의 희소 또는 모자이크 표지는 두 가지 문제를 모두 해결합니다: 형광 마커는 세포를 채워 모든 가지를 포착하고 이웃과 구별될 수 있는 개별 성상세포의 이미징을 가능하게 합니다. 바이러스 주입, 플라스미드 전기천공, 또는 트랜스제닉 마우스 라인을 포함하는 유전자 조작의 유무에 관계없이 성상세포의 희소 형광 표지를 달성하기 위해 몇 가지 상이한 전략이 사용되어 왔다. 이러한 전략의 실행에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 연구 및 프로토콜 1,7,8,9,10,11,12,13에 설명되어 있다.
이 기사에서는 희소 한 성상 세포 집단에서 형광 표지로 마우스 뇌에서 성상 세포 영역 부피를 측정하는 방법을 설명합니다 (그림 1). 마우스 피질에서 성상세포의 평균 직경은 대략 60 μm이기 때문에, 100 μm 두께의 절편은 개별 성상세포 전체를 포획하는 효율을 향상시키기 위해 사용된다. 면역 염색은 필요하지 않지만 공초점 이미징 및 분석을 위해 내인성 형광 신호를 향상시키는 것이 좋습니다. 면역 염색은 또한 미세 성상 세포 가지의 더 나은 검출을 가능하게하고 이미지 획득 동안 내인성 단백질의 광표백을 감소시킬 수 있습니다. 두꺼운 절편으로의 항체 침투를 개선하고, 영상화를 통한 절편화로부터 조직 부피를 보존하기 위해, 자유-부유 조직 절편이 사용된다. 성상세포 영역 부피의 분석은 상업적으로 이용가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 추가적으로, 이 프로토콜은 모자이크 표지를 갖는 조직 절편에서 성상세포 타일링을 분석하는 방법을 기술하며, 여기서 이웃 성상세포는 상이한 형광 표지를 발현한다. 이 프로토콜은 최근 여러 연구에서 성공적으로 사용되어 왔으며 1,8,9 정상적인 뇌 발달 중 성상 세포 성장뿐만 아니라 유전자 조작이 성상 세포 발달에 미치는 영향을 특성화합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 마우스 피질에서 성상세포 영역 부피 및 성상세포 타일링을 분석하기 위한 확립된 방법을 설명하며, 관류로 시작하여 이미지 분석으로 끝나는 모든 주요 단계를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 성상세포의 희소 또는 모자이크 집단에서 형광 단백질을 발현하는 마우스의 뇌를 필요로 한다. 이 요구 사항 외에, 임의의 연령의 마우스가 이 프로토콜에 사용될 수 있으며, 관류 설정?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
현미경 검사는 UNC 신경 과학 현미경 코어 (RRID : SCR_019060)에서 수행되었으며, NIH-NINDS 신경 과학 센터 지원 보조금 P30 NS045892 및 NIH-NICHD 지적 발달 장애 연구 센터 지원 보조금 U54 HD079124의 기금으로 부분적으로 지원되었습니다. 그림 1은 BioRender.com 로 작성되었습니다. 그림 4의 이미지와 데이터는 출판사의 허가를 받아 이전 간행물(9 )에서 재인쇄된다.
Materials
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
References
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