複数の蛍光染色および組織クリアリングアプローチを使用した3Dパターンでの毛状およびグラブラス皮膚神経支配の実証
Summary
組織切片の厚さは、皮膚神経支配の形態学的研究を制限した。本プロトコールは、共焦点顕微鏡下で厚さ300μmの組織切片中の皮膚神経線維を可視化する独自の組織透明化技術を記載する。
Abstract
皮膚神経支配は末梢神経系の重要な部分です。皮膚神経線維の研究は急速に進歩しているが、それらの分布的および化学的特性の理解の大部分は、薄い組織切片に対する従来の組織化学的および免疫組織化学的染色から来ている。組織透明化技術の開発により、より厚い組織切片上の皮膚神経線維を見ることが可能となった。本プロトコールは、ラット後足の足底および背部皮膚から300μmの厚さで組織切片に複数の蛍光染色を記載する、2つの典型的な毛深いおよびグラブラスな皮膚部位である。ここで、カルシトニン遺伝子関連ペプチドは感覚神経線維を標識し、一方ファロイジン及びリンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1は血液及びリンパ管をそれぞれ標識する。共焦点顕微鏡下では、標識された感覚神経線維は、より長い距離で完全に追跡され、深い皮膚層では束状に、表層ではフリースタイルで走った。これらの神経線維は血管と平行に走ったり、血管を囲んだりして、リンパ管は毛むくじゃらでグラブラスな皮膚に3次元(3D)ネットワークを形成しました。現在のプロトコルは、方法論の観点から既存の従来の方法よりも皮膚神経支配を研究するためのより効果的なアプローチを提供する。
Introduction
皮膚は、環境への重要なインターフェースとして機能する体内最大の器官であり、多くの神経線維1,2,3によって密に神経支配されている。皮膚神経支配は、全マウント皮膚および組織切片4,5,6に対する染色など、様々な組織学的方法を用いて以前に広く研究されてきたが、皮膚神経線維の詳細な効果的な実証は依然として課題である7,8。これを踏まえ、本プロトコールは、厚い組織切片において皮膚神経線維をより明確に示すための独自の技術を開発した。
切片の太さによる限界のため、神経支配皮膚神経線維の観察は、取得した画像情報からカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)神経線維と局所組織・臓器との関係を正確に描くほど正確ではない。3D組織クリアリング技術の出現は、この問題を解決するための実行可能な方法を提供する9,10。組織クリアリングアプローチの急速な発展は、近年、組織構造、器官全体、ニューロン突起、および動物全体を研究するための多くのツールを提供してきました11。透明な皮膚組織は、共焦点顕微鏡によってはるかに厚い部分で画像化され、皮膚神経線維を視覚化するためのデータを得ることができる。
現在の研究では、ラット後足の足底および背部皮膚を、毛状およびグラブラス性皮膚の2つの標的部位として選択した3、4、7。より長い距離で皮膚神経線維をトレースするために、皮膚組織を免疫組織化学的および組織化学的染色のために300μmの厚さでスライスし、続いて組織透明化処置を行った。CGRPは、感覚神経線維12、13を標識するために使用した。さらに、組織背景上の皮膚神経線維を強調するために、ファロイジンおよびリンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1(LYVE1)をさらに用いて、それぞれ血管およびリンパ管を標識した14、15。
これらのアプローチは、皮膚神経線維の高解像度ビューを実証し、また、皮膚の神経線維、血管、およびリンパ管間の空間的相関を視覚化するために適用することができる直接的な方法を提供し、正常な皮膚の恒常性および病理学的条件下での皮膚の変化を理解するためのはるかに多くの情報を提供し得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究は、皮膚神経支配をよりよく理解するために、より厚い組織切片に免疫蛍光を用いて、より厚い組織切片に免疫蛍光を用いて、皮膚神経支配をよりよく理解することによって、毛状およびグラブラス皮膚における皮膚神経線維の詳細な実証を提供する。抗体インキュベーション時間は最大1〜2日で、一晩の洗浄プロセスが重要です。これら2つの重要なステップは、厚い切片の免疫蛍光?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国医学科学院イノベーション基金(プロジェクトコードNo.CI2021A03404)および国立漢方薬学際的イノベーション基金(プロジェクトコード番号。ZYYCXTD-D-202202)。
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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