Biochemische zuivering en proteomische karakterisering van amyloïde fibrilkernen uit de hersenen
Summary
Deze biochemische zuiveringsmethode met op massaspectrometrie gebaseerde proteomische analyse vergemakkelijkt de robuuste karakterisering van amyloïde fibrilkernen, wat de identificatie van doelen voor het voorkomen van de ziekte van Alzheimer kan versnellen.
Abstract
Eiwithoudende fibrillaire insluitsels zijn belangrijke pathologische kenmerken van meerdere neurodegeneratieve ziekten. In de vroege stadia van de ziekte van Alzheimer (AD) vormen amyloïde-bètapeptiden protofibrillen in de extracellulaire ruimte, die fungeren als zaden die geleidelijk groeien en rijpen tot grote amyloïde plaques. Ondanks dit basisbegrip is de huidige kennis van de amyloïde fibrilstructuur, samenstelling en afzettingspatronen in de hersenen beperkt. Een belangrijke barrière is het onvermogen om sterk gezuiverde amyloïde fibrillen uit hersenextracten te isoleren. Affiniteitszuivering en laservangst microdissectie-gebaseerde benaderingen zijn eerder gebruikt om amyloïden te isoleren, maar worden beperkt door de kleine hoeveelheid materiaal die kan worden teruggewonnen. Dit nieuwe, robuuste protocol beschrijft de biochemische zuivering van amyloïde plaquekernen met behulp van natriumdodecylsulfaat (SDS) oplosbaarheid met sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en ultrasoon geluid en levert zeer zuivere fibrillen van AD-patiënten en AD-model hersenweefsels. Massaspectrometrie (MS) -gebaseerde bottom-up proteomische analyse van het gezuiverde materiaal vertegenwoordigt een robuuste strategie om bijna alle primaire eiwitcomponenten van amyloïde fibrillen te identificeren. Eerdere proteomische studies van eiwitten in de amyloïde coronae hebben een onverwacht grote en functioneel diverse verzameling eiwitten onthuld. Met name na het verfijnen van de zuiveringsstrategie werd het aantal co-zuiverende eiwitten met meer dan 10-voudig verminderd, wat wijst op de hoge zuiverheid van het geïsoleerde SDS-onoplosbare materiaal. Negatieve kleuring en immuno-goud elektronenmicroscopie maakten bevestiging van de zuiverheid van deze preparaten mogelijk. Verdere studies zijn nodig om de ruimtelijke en biologische kenmerken te begrijpen die bijdragen aan de afzetting van deze eiwitten in amyloïde insluitsels. Alles bij elkaar genomen is deze analytische strategie goed gepositioneerd om het begrip van amyloïde biologie te vergroten.
Introduction
Amyloïde is een extreem stabiele supramoleculaire opstelling die wordt aangetroffen in een divers panel van eiwitten, waarvan sommige leiden tot pathologische veranderingen1. De accumulatie van intra- of extracellulaire amyloïde aggregaten wordt waargenomen bij verschillende neurodegeneratieve ziekten2. Amyloïde aggregaten zijn heterogeen en verrijkt met een groot aantal eiwitten en lipiden3. In de afgelopen jaren heeft de interesse in het amyloïde proteoom aanzienlijke interesse gewekt onder basis- en translationele neurowetenschappers. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om amyloïde aggregaten uit menselijke hersenweefsels van muizen en postmortems te extraheren en te zuiveren. Laser-capture microdissectie, immunoprecipitatie, decellularisatie en biochemische isolatie van amyloïde aggregaten zijn veelgebruikte methoden om amyloïde plaques, fibrillen en oligomerente extraheren en te zuiveren 4,5,6,7. Veel van deze studies hebben zich gericht op het bepalen van de eiwitsamenstelling van deze dicht opeengepakte fibrillaire afzettingen met behulp van semi-kwantitatieve MS. De beschikbare resultaten zijn echter inconsistent en het verrassend grote aantal co-zuiverende eiwitten dat eerder werd gerapporteerd, is een uitdaging om te interpreteren.
De primaire beperking van de bestaande literatuur die het amyloïde kernproteoom in AD- en AD-muizenmodelhersenen beschrijft, is dat het gezuiverde materiaal een onbeheersbaar aantal co-zuiverende eiwitten bevat. Het algemene doel van deze methode is om deze beperking te overwinnen en een robuuste biochemische zuivering te ontwikkelen voor het isoleren van amyloïde fibrilkernen. Deze strategie maakt gebruik van een eerder beschreven sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie-gebaseerde biochemische methode voor de isolatie van SDS onoplosbare verrijkte amyloïde fracties uit post-mortem AD menselijke en muis hersenweefsels 8,9. Deze methode bouwt voort op de bestaande literatuur, maar gaat verder met ultrasoonbehandeling en SDS-wasbeurten om de meeste losjes gebonden amyloïde-geassocieerde eiwitten te verwijderen, wat leidt tot de isolatie van sterk gezuiverde amyloïde fibrillen (figuur 1). De fibrillen die door dit protocol worden gezuiverd, overwinnen verschillende bestaande uitdagingen die vaak worden aangetroffen in structurele studies van amyloïde fibrillen geïsoleerd uit hersenextracten. Visualisatie van deze fibrillen met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) bevestigt de integriteit en zuiverheid van het gezuiverde materiaal (figuur 2). In deze studie worden de geïsoleerde fibrillen opgelost en verteerd tot peptiden met trypsine, en labelvrije MS-analyse kan gemakkelijk de identiteit onthullen van de eiwitten die de fibrilkern vormen. Met name sommige van deze eiwitten hebben een inherente neiging om supramoleculaire assemblages te vormen in niet-membraangebonden organellen. Bovendien zijn veel van de eiwitten die zijn geïdentificeerd in de analyse van amyloïde-bèta (Aβ) fibrillen ook geassocieerd met andere neurodegeneratieve ziekten, wat suggereert dat deze eiwitten een sleutelrol kunnen spelen bij meerdere proteïnopathieën.
Het is onwaarschijnlijk dat deze SDS / ultrasone methode de structuur van de fibrilkernen zal veranderen of verstoren. Het gezuiverde materiaal is ook geschikt voor een breed scala aan top-down en bottom-up proteomische analysebenaderingen en aanvullende ms-gebaseerde structurele analysestrategieën, zoals chemische crosslinking of waterstof-deuteriumuitwisseling. Het totale herstel met behulp van deze methode is relatief hoog en is dus geschikt voor gedetailleerde structurele studies, waarvoor microgram tot milligram van het gezuiverde materiaal nodig is. Het gezuiverde materiaal is ook geschikt voor structurele studies met cryoEM en atoomkrachtmicroscopie. Dit protocol, in combinatie met de stabiele isotopische etikettering van zoogdieren, kan solid-state nucleaire magnetische resonantie (NMR) studies van amyloïde structuur10 vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het ontwikkelen van een duidelijk begrip van de amyloïde structuur en samenstelling is een uitdaging voor structurele biologen en biochemici vanwege de biologische complexiteit en experimentele beperkingen bij het extraheren van gezuiverde fibrillen uit AD-hersenweefsels16,17. Amyloïde fibrillen zijn polymorf op moleculair niveau en vertonen een heterogene populatie van verschillende lengtes en complexiteiten18,19<sup class="x…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidie R01AG061865 aan R.J.V. en J.N.S. De auteurs bedanken Vassar en Savas onderzoeksgroepsleden aan de Northwestern University voor hun doordachte discussies. We bedanken dr(en) ook oprecht. Ansgar Seimer en Ralf Langen van de University of South California voor hun cruciale inbreng. We bedanken Dr. Farida Korabova voor monstervoorbereiding en negatieve kleuring elektronenmicroscopie beeldvorming aan het Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Materials
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
- Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
- Rambaran, R. N., Serpell, L. C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly. Prion. 2 (3), 112-117 (2008).
- Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
- Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
- Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
- Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
- Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
- Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer’s disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
- Lu, J. -. X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer’s disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
- Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
- Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
- Spijker, S., Li, K. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).
- Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer’s disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
- Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
- Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
- Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
- Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
- Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
- Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
- Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
- Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
- Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
- Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
- Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington’s disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
- Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
- Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
- Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease brain. Alzheimer’s Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
- Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
- Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer’s β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
- Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
- Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer’s disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
- Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).
