Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn
Summary
Diese biochemische Reinigungsmethode mit massenspektrometriebasierter Proteomanalyse erleichtert die robuste Charakterisierung von Amyloidfibrillenkernen, was die Identifizierung von Zielen zur Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit beschleunigen kann.
Abstract
Proteinaceous fibrilläre Einschlüsse sind wichtige pathologische Kennzeichen mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen. In den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit (AD) bilden Amyloid-Beta-Peptide Protofibrillen im extrazellulären Raum, die als Samen fungieren, die allmählich wachsen und zu großen Amyloid-Plaques reifen. Trotz dieses grundlegenden Verständnisses ist das derzeitige Wissen über die Struktur, Zusammensetzung und Ablagerungsmuster von Amyloidfibrillen im Gehirn begrenzt. Eine Hauptbarriere war die Unfähigkeit, hochgereinigte Amyloidfibrillen aus Gehirnextrakten zu isolieren. Affinitätsreinigungs- und Lasereinfang-Mikrodissektions-basierte Ansätze wurden bisher zur Isolierung von Amyloiden verwendet, sind jedoch durch die geringe Menge an Material, die zurückgewonnen werden kann, begrenzt. Dieses neuartige, robuste Protokoll beschreibt die biochemische Reinigung von Amyloid-Plaquekernen unter Verwendung der Natriumdodecylsulfat (SDS) -Solubilisierung mit Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Ultraschall und liefert hochreine Fibrillen von AD-Patienten und AD-Modell-Hirngeweben. Die auf Massenspektrometrie (MS) basierende proteomische Bottom-up-Proteomanalyse des gereinigten Materials stellt eine robuste Strategie zur Identifizierung fast aller primären Proteinkomponenten von Amyloidfibrillen dar. Frühere proteomische Studien von Proteinen in der Amyloidkorone haben eine unerwartet große und funktionell vielfältige Sammlung von Proteinen ergeben. Insbesondere wurde nach der Verfeinerung der Reinigungsstrategie die Anzahl der mitreinigenden Proteine um mehr als das 10-fache reduziert, was auf die hohe Reinheit des isolierten unlöslichen SDS-Materials hinweist. Negative Färbung und Immun-Gold-Elektronenmikroskopie ermöglichten die Bestätigung der Reinheit dieser Präparate. Weitere Studien sind erforderlich, um die räumlichen und biologischen Eigenschaften zu verstehen, die zur Ablagerung dieser Proteine in Amyloideinschlüsse beitragen. Zusammengenommen ist diese analytische Strategie gut positioniert, um das Verständnis der Amyloidbiologie zu verbessern.
Introduction
Amyloid ist eine extrem stabile supramolekulare Anordnung, die in einer Vielzahl von Proteinen vorkommt, von denen einige zu pathologischen Veränderungen führen1. Die Akkumulation von intra- oder extrazellulären Amyloidaggregaten wird bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungenbeobachtet 2. Amyloid-Aggregate sind heterogen und mit einer Vielzahl von Proteinen und Lipiden angereichert3. In den letzten Jahren hat das Interesse am Amyloid-Proteom bei grundlegenden und translationalen Neurowissenschaftlern ein erhebliches Interesse geweckt. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Amyloidaggregate aus Maus- und postmortalem menschlichem Hirngewebe zu extrahieren und zu reinigen. Laser-Capture-Mikrodissektion, Immunpräzipitation, Dezellularisierung und biochemische Isolierung von Amyloid-Aggregaten sind weit verbreitete Methoden zur Extraktion und Reinigung von Amyloid-Plaques, Fibrillen und Oligomeren 4,5,6,7. Viele dieser Studien haben sich darauf konzentriert, die Proteinzusammensetzung dieser dicht gepackten fibrillären Ablagerungen unter Verwendung von semiquantitativer MS zu bestimmen. Die verfügbaren Ergebnisse sind jedoch inkonsistent, und die überraschend große Anzahl von Co-Cleanifying-Proteinen, die zuvor berichtet wurden, sind schwierig zu interpretieren.
Die primäre Einschränkung der bestehenden Literatur, die das Amyloidkernproteom in AD- und AD-Mausmodellgehirnen beschreibt, besteht darin, dass das gereinigte Material eine unüberschaubare Anzahl von mitreinigenden Proteinen enthält. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, diese Einschränkung zu überwinden und eine robuste biochemische Reinigung zur Isolierung von Amyloidfibrillenkernen zu entwickeln. Diese Strategie verwendet eine zuvor beschriebene auf Succharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende biochemische Methode zur Isolierung von SDS-unlöslichen angereicherten Amyloidfraktionen aus postmortalem AD-Hirngewebevon Menschen und Mäusen 8,9. Diese Methode baut auf der vorhandenen Literatur auf, geht aber mit Ultraschall und SDS-Waschungen weiter, um die meisten der lose gebundenen Amyloid-assoziierten Proteine zu entfernen, was zur Isolierung von hochgereinigten Amyloidfibrillen führt (Abbildung 1). Die durch dieses Protokoll gereinigten Fibrillen überwinden mehrere bestehende Herausforderungen, die häufig in Strukturstudien von Amyloidfibrillen auftreten, die aus Gehirnextrakten isoliert wurden. Die Visualisierung dieser Fibrillen mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt die Integrität und Reinheit des gereinigten Materials (Abbildung 2). In dieser Studie werden die isolierten Fibrillen mit Trypsin gelöst und zu Peptiden verdaut, und eine markierungsfreie MS-Analyse kann die Identität der Proteine, die den Fibrillenkern bilden, leicht aufdecken. Insbesondere haben einige dieser Proteine eine inhärente Tendenz, supramolekulare Anordnungen in nicht membrangebundenen Organellen zu bilden. Darüber hinaus sind viele der Proteine, die bei der Analyse von Amyloid-Beta (Aβ)-Fibrillen identifiziert wurden, auch mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert, was darauf hindeutet, dass diese Proteine eine Schlüsselrolle bei multiplen Proteinopathien spielen können.
Es ist unwahrscheinlich, dass diese SDS / Ultraschallmethode die Struktur der Fibrillenkerne verändert oder stört. Das gereinigte Material eignet sich auch für eine Vielzahl von Top-down- und Bottom-up-Proteomanalyseansätzen und zusätzlichen MS-basierten Strukturanalysestrategien, wie chemische Vernetzung oder Wasserstoff-Deuterium-Austausch. Die Gesamtausbeute mit dieser Methode ist relativ hoch und eignet sich daher für detaillierte Strukturuntersuchungen, die Mikrogramm bis Milligramm des gereinigten Materials erfordern. Das gereinigte Material eignet sich auch für Strukturuntersuchungen mittels KryoEM und Rasterkraftmikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit der stabilen Isotopenmarkierung von Säugetieren Festkörper-Kernspinresonanzuntersuchungen (NMR) derAmyloidstruktur 10 erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung eines klaren Verständnisses der Struktur und Zusammensetzung von Amyloiden ist für Strukturbiologen und Biochemiker aufgrund der biologischen Komplexität und der experimentellen Einschränkungen bei der Extraktion gereinigter Fibrillen aus AD-Hirngewebeneine Herausforderung 16,17. Amyloidfibrillen sind auf molekularer Ebene polymorph und zeigen eine heterogene Population unterschiedlicher Länge und Komplexität18,19<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss R01AG061865 an R.J.V. und J.N.S. unterstützt. Die Autoren danken Vassar und den Mitgliedern der Savas-Forschungsgruppe an der Northwestern University für ihre nachdenklichen Diskussionen. Wir danken auch herzlich Dr. s. Ansgar Seimer und Ralf Langen von der University of South California für ihren entscheidenden Input. Wir danken Dr. Farida Korabova für die Probenvorbereitung und die Bildgebung negativer Färbeelektronenmikroskopie am Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Materials
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
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