Purification biochimique et caractérisation protéomique des noyaux de fibrilles amyloïdes du cerveau

Arun Upadhyay; Robert J. Vassar; Jeffrey N. Savas

doi:10.3791/63816

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Article de méthode

Purification biochimique et caractérisation protéomique des noyaux de fibrilles amyloïdes du cerveau

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DOI :

10.3791/63816

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28 avril 2022

Arun Upadhyay¹ , Robert J. Vassar¹ , Jeffrey N. Savas¹

¹Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Cette méthode de purification biochimique avec analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse facilite la caractérisation robuste des noyaux de fibrilles amyloïdes, ce qui peut accélérer l’identification de cibles pour la prévention de la maladie d’Alzheimer.

Résumé

Les inclusions fibrillaires protéiques sont des caractéristiques pathologiques clés de multiples maladies neurodégénératives. Dans les premiers stades de la maladie d’Alzheimer (MA), les peptides bêta-amyloïdes forment des protofibrilles dans l’espace extracellulaire, qui agissent comme des graines qui se développent progressivement et mûrissent en grandes plaques amyloïdes. Malgré cette compréhension de base, les connaissances actuelles sur la structure, la composition et les modèles de dépôt des fibrilles amyloïdes dans le cerveau sont limitées. Une barrière majeure a été l’incapacité d’isoler les fibrilles amyloïdes hautement purifiées des extraits de cerveau. Des approches basées sur la purification par affinité et la capture laser par microdissection ont déjà été utilisées pour isoler les amyloïdes, mais sont limitées par la petite quantité de matériau qui peut être récupérée. Ce nouveau protocole robuste décrit la purification biochimique des noyaux de plaque amyloïde à l’aide de la solubilisation au dodécylsulfate de sodium (SDS) avec ultracentrifugation et ultrasons du gradient de densité de saccharose et donne des fibrilles très pures de patients atteints de MA et de tissus cérébraux modèles de DA. L’analyse protéomique ascendante basée sur la spectrométrie de masse (SEP) du matériau purifié représente une stratégie robuste pour identifier presque tous les composants protéiques primaires des fibrilles amyloïdes. Des études protéomiques antérieures sur les protéines de la couronne amyloïde ont révélé une collection de protéines étonnamment grande et fonctionnellement diversifiée. Notamment, après avoir affiné la stratégie de purification, le nombre de protéines co-purifiantes a été réduit de plus de 10 fois, ce qui indique la grande pureté du matériau insoluble isolé SDS. La coloration négative et la microscopie électronique immuno-or ont permis de confirmer la pureté de ces préparations. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les attributs spatiaux et biologiques qui contribuent au dépôt de ces protéines dans les inclusions amyloïdes. Dans l’ensemble, cette stratégie analytique est bien positionnée pour améliorer la compréhension de la biologie amyloïde.

Introduction

L’amyloïde est un arrangement supramoléculaire extrêmement stable que l’on trouve dans un panel diversifié de protéines, dont certaines conduisent à des changements pathologiques¹. L’accumulation d’agrégats amyloïdes intra- ou extracellulaires est observée dans plusieurs maladies neurodégénératives². Les agrégats amyloïdes sont hétérogènes et sont enrichis d’un grand nombre de protéines et de lipides³. Au cours des dernières années, l’intérêt pour le protéome amyloïde a suscité un intérêt considérable parmi les neuroscientifiques de base et translationnels. Plusieurs méthodes ont été mises au poin....