Denna biokemiska reningsmetod med masspektrometribaserad proteomisk analys underlättar robust karakterisering av amyloidfibrilkärnor, vilket kan påskynda identifieringen av mål för att förebygga Alzheimers sjukdom.
Proteinhaltiga fibrillära inneslutningar är viktiga patologiska kännetecken för flera neurodegenerativa sjukdomar. I de tidiga stadierna av Alzheimers sjukdom (AD) bildar amyloid-beta-peptider protofibriller i det extracellulära utrymmet, som fungerar som frön som gradvis växer och mognar till stora amyloidplack. Trots denna grundläggande förståelse är nuvarande kunskap om amyloidfibrilstruktur, sammansättning och deponeringsmönster i hjärnan begränsad. En viktig barriär har varit oförmågan att isolera högrenade amyloidfibriller från hjärnextrakt. Affinitetsrening och laserfångande mikrodissektionsbaserade metoder har tidigare använts för att isolera amyloider men begränsas av den lilla mängd material som kan återvinnas. Detta nya, robusta protokoll beskriver den biokemiska reningen av amyloida plackkärnor med användning av natriumdodecylsulfat (SDS) solubilisering med sackarosdensitetsgradient ultracentrifugering och ultraljud och ger mycket rena fibriller från AD-patienter och AD-modell hjärnvävnader. Masspektrometri (MS) -baserad bottom-up proteomisk analys av det renade materialet representerar en robust strategi för att identifiera nästan alla primära proteinkomponenter i amyloidfibriller. Tidigare proteomiska studier av proteiner i amyloidkoronan har avslöjat en oväntat stor och funktionellt varierad samling proteiner. Särskilt, efter raffinering av reningsstrategin, reducerades antalet samrenande proteiner med mer än 10 gånger, vilket indikerar den höga renheten hos det isolerade SDS-olösliga materialet. Negativ färgning och immuno-guldelektronmikroskopi möjliggjorde bekräftelse av renheten hos dessa preparat. Ytterligare studier krävs för att förstå de rumsliga och biologiska attribut som bidrar till avsättningen av dessa proteiner till amyloidinklusioner. Sammantaget är denna analytiska strategi väl positionerad för att öka förståelsen för amyloidbiologi.
Amyloid är ett extremt stabilt supramolekylärt arrangemang som finns i en mångsidig panel av proteiner, av vilka några leder till patologiska förändringar1. Ackumuleringen av intra- eller extracellulära amyloidaggregat observeras i flera neurodegenerativa sjukdomar2. Amyloidaggregat är heterogena och berikas med ett stort antal proteiner och lipider3. Under de senaste åren har intresset för amyloidproteomet genererat ett stort intresse bland grundläggande och translationella neuroforskare. Flera metoder har utvecklats för att extrahera och rena amyloidaggregat från mus- och obduktionsvävnader i hjärnan. Laserfångande mikrodissektion, immunoprecipitation, decellularisering och biokemisk isolering av amyloidaggregat används ofta metoder för att extrahera och rena amyloidplack, fibriller och oligomerer 4,5,6,7. Många av dessa studier har fokuserat på att bestämma proteinsammansättningen hos dessa tätt packade fibrillära avlagringar med hjälp av semikvantitativ MS. De tillgängliga resultaten är dock inkonsekventa, och det förvånansvärt stora antalet samrenande proteiner som tidigare rapporterats är utmanande att tolka.
Den primära begränsningen i den befintliga litteraturen som beskriver amyloidkärnans proteom i AD- och AD-musmodellhjärnor är att det renade materialet innehåller ett ohanterligt antal samrenande proteiner. Det övergripande målet med denna metod är att övervinna denna begränsning och utveckla en robust biokemisk rening för isolering av amyloidfibrilkärnor. Denna strategi använder en tidigare beskriven sackarosdensitetsgradient ultracentrifugeringsbaserad biokemisk metod för isolering av SDS olösliga berikade amyloidfraktioner från post mortem AD mänskliga och mus hjärnvävnader 8,9. Denna metod bygger på den befintliga litteraturen men går längre med ultraljud och SDS tvättar för att ta bort de flesta av de löst bundna amyloidassocierade proteinerna, vilket leder till isolering av högrenade amyloidfibriller (Figur 1). Fibrillerna renade av detta protokoll övervinner flera befintliga utmaningar som ofta uppstår i strukturella studier av amyloidfibriller isolerade från hjärnextrakt. Visualisering av dessa fibriller med transmissionselektronmikroskopi (TEM) bekräftar det renade materialets integritet och renhet (figur 2). I denna studie solubiliseras de isolerade fibrillerna och smälts till peptider med trypsin, och etikettfri MS-analys kan lätt avslöja identiteten hos proteinerna som bildar fibrilkärnan. I synnerhet har några av dessa proteiner en inneboende tendens att bilda supramolekylära sammansättningar i icke-membranbundna organeller. Dessutom är många av de proteiner som identifierats i analysen av amyloid-beta (Aβ) fibriller också associerade med andra neurodegenerativa sjukdomar, vilket tyder på att dessa proteiner kan spela en nyckelroll i flera proteinopatier.
Denna SDS/ultraljud metod är osannolikt att ändra eller störa strukturen av fibril kärnor. Det renade materialet är också lämpligt för ett brett spektrum av top-down och bottom-up proteomiska analysmetoder och ytterligare MS-baserade strukturella analysstrategier, såsom kemisk tvärbindning eller väte-deuteriumutbyte. Den totala återvinningen med denna metod är relativt hög och är således lämplig för detaljerade strukturella studier, som kräver mikrogram till milligram av det renade materialet. Det renade materialet är också lämpligt för strukturella studier med kryoEM och atomkraftmikroskopi. Detta protokoll, i kombination med den stabila isotopmärkningen av däggdjur, kan underlätta fast-state kärnmagnetisk resonans (NMR) studier av amyloid struktur10.
Att utveckla en tydlig förståelse för amyloidstruktur och sammansättning är utmanande för strukturbiologer och biokemister på grund av de biologiska komplexiteterna och experimentella begränsningarna vid extraktion av renade fibriller från AD-hjärnvävnader16,17. Amyloidfibriller är polymorfa på molekylär nivå och visar en heterogen population av varierande längd och komplexitet18,19. För …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH-bidraget R01AG061865 till R.J.V. och J.N.S. Författarna tackar Vassar och Savas forskargruppsmedlemmar vid Northwestern University för deras tankeväckande diskussioner. Vi tackar också uppriktigt Dr (s). Ansgar Seimer och Ralf Langen vid University of South California för deras avgörande insats. Vi tackar Dr Farida Korabova för provberedning och negativ färgning av elektronmikroskopi vid Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |