Chip glomerulo renale isogenico ingegnerizzato da cellule staminali pluripotenti indotte umane
Summary
Presentato qui è un protocollo per progettare un sistema organo-on-a-chip personalizzato che ricapitola la struttura e la funzione della barriera di filtrazione glomerulare renale integrando cellule endoteliali epiteliali e vascolari geneticamente abbinate differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo sistema bioingegnerizzato può far progredire la medicina di precisione renale e le applicazioni correlate.
Abstract
La malattia renale cronica (CKD) colpisce il 15% della popolazione adulta degli Stati Uniti, ma l’istituzione di terapie mirate è stata limitata dalla mancanza di modelli funzionali in grado di prevedere con precisione le risposte biologiche umane e la nefrotossicità. I progressi nella medicina di precisione renale potrebbero aiutare a superare questi limiti. Tuttavia, i modelli in vitro precedentemente stabiliti del glomerulo renale umano – il sito primario per la filtrazione del sangue e un bersaglio chiave di molte malattie e tossicità dei farmaci – impiegano tipicamente popolazioni cellulari eterogenee con caratteristiche funzionali limitate e background genetici senza pari. Queste caratteristiche limitano significativamente la loro applicazione per la modellazione della malattia specifica del paziente e la scoperta terapeutica.
Questo articolo presenta un protocollo che integra l’epitelio glomerulare derivato dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPS) e l’endotelio vascolare da un singolo paziente per progettare un chip glomerulo renale microfluidico isogenico e vascolarizzato. Il chip glomerulo risultante è costituito da strati di cellule endoteliali ed epiteliali derivati da cellule staminali che esprimono marcatori specifici del lignaggio, producono proteine di membrana basale e formano un’interfaccia tessuto-tessuto simile alla barriera di filtrazione glomerulare del rene. Il chip glomerulo ingegnerizzato filtra selettivamente le molecole e ricapitola il danno renale indotto da farmaci. La capacità di ricostituire la struttura e la funzione del glomerulo renale utilizzando tipi di cellule isogeniche crea l’opportunità di modellare la malattia renale con la specificità del paziente e far progredire l’utilità degli organi su chip per la medicina di precisione renale e le applicazioni correlate.
Introduction
I dispositivi organ-on-a-chip sono modelli dinamici 3D in vitro che impiegano la stimolazione molecolare e meccanica, nonché la vascolarizzazione, per formare interfacce tessuto-tessuto che modellano la struttura e la funzione di organi specifici. I dispositivi organ-on-a-chip precedentemente stabiliti che miravano a ricapitolare il glomerulo del rene (chip di glomerulo) consistevano in linee cellulari animali1 o linee cellulari primarie e immortalizzate umane di fonti eterogenee 2,3. L’uso di fonti cellulari geneticamente eterogenee presenta variazioni che limitano significativamente gli studi sulle risposte paziente-specifiche e sulla genetica o sui meccanismi di malattia 4,5. Affrontare questa sfida dipende dalla disponibilità di linee cellulari isogeniche provenienti da individui specifici con profili molecolari e genetici conservati per fornire un microambiente più accurato per l’ingegneria di modelli in vitro 2,3,6. Le linee cellulari isogeniche di origine umana possono ora essere facilmente generate grazie ai progressi nella coltura di cellule iPS umane. Poiché le cellule iPS umane sono tipicamente di origine non invasiva, possono auto-rinnovarsi indefinitamente e differenziarsi in quasi tutti i tipi di cellule, servono come fonte attraente di cellule per la creazione di modelli in vitro, come il chip glomerulo 7,8. La barriera di filtrazione glomerulare è il sito principale per la filtrazione del sangue. Il sangue viene prima filtrato attraverso l’endotelio vascolare, la membrana basale glomerulare e infine attraverso epitelio specializzato chiamato podocit. Tutti e tre i componenti della barriera di filtrazione contribuiscono alla filtrazione selettiva delle molecole. Presentato qui è un protocollo per stabilire un dispositivo organ-on-a-chip interfacciato con endotelio vascolare ed epitelio glomerulare da una singola fonte di cellule iPS umane. Mentre questo protocollo è particolarmente utile per progettare un chip isogenico e vascolarizzato per ricapitolare la barriera di filtrazione glomerulare, fornisce anche un modello per lo sviluppo di altri tipi di organi su chip personalizzati e piattaforme multi-organo come un sistema isogenico “body-on-a-chip”.
Il protocollo qui descritto inizia con la differenziazione divergente delle cellule iPS umane in due linee separate: mesoderma laterale e cellule mesodermiche, che vengono successivamente differenziate rispettivamente in endotelio vascolare ed epitelio glomerulare. Per generare cellule mesodermiche laterali, le cellule iPS umane sono state seminate su piastre rivestite di matrice 1 della membrana basale e coltivate per 3 giorni (senza scambio di media) in terreno N2B27 integrato con l’attivatore Wnt, CHIR 99021, e il potente induttore del mesoderma, osso-morfogenetico 4 (BMP4). Le cellule del mesoderma laterale risultanti erano precedentemente caratterizzate dall’espressione di brachyury (T), mix paired-like homeobox (MIXL) ed eomesodermin (EOMES)9. Successivamente, le cellule del mesoderma laterale sono state coltivate per 4 giorni in un mezzo integrato con VEGF165 e Forskolin per indurre cellule endoteliali vascolari che sono state selezionate in base all’espressione di VE-Cadherin e / o PECAM-1 utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Le cellule endoteliali vascolari risultanti (viEC) sono state espanse coltivandole su matraccio rivestiti con matrice basale a 3 della membrana basale fino al momento di seminare nel dispositivo microfluidico.
Per generare cellule mesodermiche, le cellule iPS umane sono state seminate su piastre rivestite con matrice di membrana basale 2 e coltivate per 2 giorni in un mezzo contenente Activina A e CHIR99021. Le cellule del mesoderma risultanti erano caratterizzate dall’espressione di HAND1, goosecoide e brachury (T) come descritto in precedenza 2,10,11. Per indurre la differenziazione delle cellule del mesoderma intermedio (IM), le cellule del mesoderma sono state coltivate per 14 giorni in un terreno integrato con BMP-7 e CHIR99021. Le cellule IM risultanti esprimono il tumore 1 di Wilm (WT1), il gene box accoppiato 2 (PAX2) e la proteina 1 correlata a salto dispari (OSR-1)2,10,11.
Un chip microfluidico a base di polidimetilsilossano (PDMS) a due canali è stato progettato per ricapitolare la struttura della barriera di filtrazione glomerulare in vitro. Il canale urinario è 1.000 μm x 1.000 μm (l x ora) e la dimensione del canale capillare è 1.000 μm x 200 μm (l x ora). I cicli ciclici di stretching e rilassamento erano facilitati dalle camere cave presenti su ciascun lato dei canali fluidici. Le cellule sono state seminate su una membrana flessibile PDMS (50 μm di spessore) che separa i canali urinario e capillare. La membrana è dotata di pori esagonali (7 μm di diametro, 40 μm di distanza) per contribuire a promuovere la segnalazione intercellulare (Figura 1A)2,12. Due giorni prima che l’induzione IM fosse completa, i chip microfluidici sono stati rivestiti con matrice di membrana basale 2. I viECs sono stati seminati nel canale capillare del chip microfluidico utilizzando il mezzo di mantenimento endoteliale 1 giorno prima che l’induzione IM fosse completa e il chip è stato capovolto per consentire l’adesione cellulare sul lato basale della membrana PDMS rivestita di ECM. Il giorno in cui è stata completata l’induzione IM, le cellule sono state seminate nel canale urinario del chip microfluidico utilizzando un mezzo integrato con BMP7, Activina A, CHIR99021, VEGF165 e tutto l’acido trans retinoico per indurre la differenziazione dei podociti all’interno del chip. Il giorno seguente, i serbatoi dei fluidi sono stati riempiti con mezzo di induzione podocita e mezzo di mantenimento endoteliale, e il 10% di sforzo meccanico a 0,4 Hz e flusso di fluido (60 μL / h) sono stati applicati ai trucioli.
I chip microfluidici cellularizzati sono stati coltivati per ulteriori 5 giorni utilizzando il mezzo di induzione podocita (nel canale urinario) e il mezzo di mantenimento endoteliale (nel canale vascolare). I chip di glomerulo renale risultanti sono stati coltivati per un massimo di 7 giorni aggiuntivi in terreni di mantenimento sia per il podocita che per le cellule endoteliali. I podociti differenziati hanno espresso positivamente proteine specifiche del lignaggio, tra cui podocina e nefrrina 13,14, mentre le viECs hanno espresso positivamente le proteine di identificazione del lignaggio PECAM-1 e VE-Cadherin, tutte molecole essenziali per mantenere l’integrità della barriera di filtrazione glomerulare 15,16 . Si è scoperto che i podociti e le viECs secernono la proteina glomerulare più abbondante della membrana basale, il collagene IV, che è anche importante per la maturazione e la funzione dei tessuti.
Il sistema a tre componenti della barriera di filtrazione – endotelio, membrana basale ed epitelio – nei chip del glomerulo è stato trovato per filtrare selettivamente le molecole e rispondere a un trattamento farmacologico chemioterapico e nefrotossico. I risultati del trattamento farmacologico hanno indicato che il chip del glomerulo può essere utilizzato per studi di nefrotossicità e per la modellizzazione della malattia. Questo protocollo fornisce le linee guida generali per la progettazione di un chip funzionale di glomerulo renale microfluidico da derivati isogeni delle cellule iPS. Le analisi a valle del chip ingegnerizzato possono essere eseguite come desiderato dal ricercatore. Per ulteriori informazioni sull’uso del chip glomerulo per modellare la lesione glomerulare indotta da farmaci, fare riferimento alle pubblicazioni precedenti 2,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo rapporto, delineiamo un protocollo per derivare l’endotelio vascolare e l’epitelio glomerulare (podociti) da una linea cellulare iPS umana isogenica e l’uso di queste cellule per progettare un sistema 3D organ-on-a-chip che imita la struttura, l’interfaccia tessuto-tessuto e la funzione di filtrazione molecolare del glomerulo renale. Questo chip glomerulo è dotato di endotelio ed epitelio glomerulare che, insieme, forniscono una barriera per filtrare selettivamente le molecole.
I r…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Pratt School of Engineering della Duke University, dalla Divisione di Nefrologia presso il Duke Department of Medicine, da una borsa di studio Whitehead in Biomedical Research e da un Genentech Research Award per S. Musah. Y. Roye ha ricevuto la borsa di studio della Duke University-Alfred P. Sloan Foundation e la William M. “Monty” Reichert Graduate Fellowship del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Duke University. La linea cellulare iPS DU11 (Duke University clone #11) è stata generata presso la Duke iPSC Core Facility e fornitaci dal Bursac Lab della Duke University. Gli autori ringraziano N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya e Y. Zhou per l’assistenza tecnica e le utili discussioni. Gli autori desiderano anche ringraziare i membri del Musah Lab per gli utili commenti sul manoscritto. Gli autori ringraziano il Segura Lab per il dono di un citometro a flusso Acuri C6.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies | Thermo/Life Technologies | A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015 | |
| Collagen IV | Thermo/Life Technologies | 14-9871-82 | |
| Nephrin | Progen | GP-N2 | |
| PECAM-1 | R&D Systems | AF806 | |
| Podocin | Abcam | ab50339 | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-9989 | |
| Basement membrane matrices | |||
| Corning Fibronectin, Human | Corning | 356008 | Basement membrane (3) |
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | Iwai North America | N8922012 | Basement membrane matrix (2) |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019) | ||
| Culture medium growth factors and media supplements | |||
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo/Life Technologies | 21985023 | |
| Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate | Thermo/Life Technologies | A23017 | |
| All-trans retinoic acid (500 mg) | Stem Cell Technologies | 72262 | |
| B27 serum-free supplement | Thermo/Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 supplement (50x) without Vitamin A | Thermo/Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | May show lot-to-lot variation |
| Complete medium kit with CultureBoost-R | Cell Systems | 4Z0-500-R | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | Thermo/Life Technologies | 12634028 | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | Thermo/Life Technologies | 10565042 | DMEM/F12 with glutamine |
| Forskolin (Adenylyl cyclase activator) | Abcam | ab120058 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo/Life Technologies | 35050061 | glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | Thermo/Life Technologies | 10082147 | |
| Heparin solution | Stem Cell Technologies | 7980 | |
| Human Activin A | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human BMP4 | Preprotech | 120-05ET | |
| Human BMP7 | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human VEGF | Thermo/Life Technologies | PHC9394 | |
| Inulin-FITC | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 05850 | Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C. |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo/Life Technologies | 17502048 | |
| Neurobasal media | Thermo/Life Technologies | 21103049 | Lateral mesoderm basal media |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo/Life Technologies | 14190-250 | |
| Penicillin-streptomycin, liquid (100x) | Thermo/Life Technologies | 15140-163 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | 1254 | |
| StemPro-34 SFM | Thermo/Life Technologies | 10639011 | Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months. |
| TGF-Beta inhibitor (SB431542) | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| Enzymes and other reagents | |||
| Accutase | Thermo/Life Technologies | A1110501 | Cell detachment buffer |
| Dimethyl Suloxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | VWR | 97065-058 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo/Life Technologies | 28906 | |
| Sterile distilled water | Thermo/Life Technologies | 15230162 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Equipment | |||
| Trypsin EDTA, 0.05% | Thermo/Life Technologies | 25300-120 | |
| (Orb) Hub module | Emulate | ORB-HM1 | |
| 100mm x 15 mm round petri dish | Fisherbrand | FB087579B | |
| 120 x 120 mm square cell culture dish | VWR | 688161 | |
| Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | Corning | 29442-462 | |
| Aspirating Unit | SP Bel-Art | F19917-0150 | |
| Avanti J-15R Centrifuge | Beckman Coulter | B99516 | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | Corning | 352098 | |
| EVOS M7000 | Thermo/Life Technologies | AMF7000 | Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells. |
| Hemocytometer | VWR | 100503-092 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo/Life Technologies | 51030403 | |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera | Carl Zeiss Micrscopy | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | VWR | 40101-346 | |
| Kimwipes, large | VWR | 21905-049 | |
| Leoca SP8 Upright Confocal Microscope | |||
| Media reservoir (POD Portable Module) | Emulate | POD-1 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Organ-chip | Emulate | S-1 Chip | |
| Organ-chip holder | Emulate | AK-CCR | |
| P10 precision barrier pipette tips | Denville Scientific | P1096-FR | |
| P100 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1125 | |
| P1000 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1121 | |
| P20 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1122 | |
| P200 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1122 | |
| Plasma Asher | Quorum tech | K1050X RF | This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF). |
| Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Corning | 352235 | |
| Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped | Corning | 356551 | |
| Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped | Corning | 356525 | |
| Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped | Corning | 356543 | |
| Steriflip, 0.22 µm, PES | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile Microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 1138W14 | |
| T75cm2 cell culture flask with vent cap | Corning | 430641U | |
| Tissue culture-treated 12 well plates | Corning | 353043 | |
| Tissue culture-treated 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) | Emulate | ZOE-CM1 | Organ Chip Bioreactor |
| VE-Cadherin CD144 anti-human antibody – APC conjugated | Miltenyi Biotec | 130-126-010 | |
| Wide-beveled cell lifter | Corning | 3008 | |
| MACS | |||
| CD144 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
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