בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין
Summary
הפרוטוקול מציג שיטה לבידוד ליזאטים של חלבונים של תאים שלמים מתהליכי פנים של עוברי עכברים שנותחו או מתאי מזנכים עובריים של עכברים שעברו תרבית, וביצוע כתמים מערביים לאחר מכן כדי להעריך את רמות החלבון שעבר זרחן.
Abstract
התפתחות קרניופציאלית של יונקים היא תהליך מורפולוגי מורכב שבמהלכו אוכלוסיות תאים מרובות מתאמות ליצירת השלד הקדמי. שינויים מורפולוגיים אלה מתחילים ומתקיימים באמצעות אינטראקציות איתות מגוונות, הכוללות לעתים קרובות זרחון חלבונים על ידי קינאזות. כאן מסופקות שתי דוגמאות להקשרים פיזיולוגיים-רלוונטיים שבאמצעותם ניתן לחקור זרחון של חלבונים במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים: תהליכי פנים של עכברים, במיוחד תהליכים מקסילריים E11.5, ותאי מזנכים עובריים של עכבר תרבית שמקורם במדפי פלטה משניים E13.5. כדי להתגבר על המחסום הנפוץ של דה-פוספורילציה במהלך בידוד חלבונים, נדונים התאמות ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטיות המאפשרות בידוד של פוספופרוטאינים. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות ניתנות לניתוח וכימות נכונים של פוספופרוטאינים בעקבות כתמים מערביים של ליזאטים של חלבון של תאים שלמים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה, במיוחד בשילוב עם מעכבים פרמקולוגיים ו/או מודלים גנטיים של מורין, כדי לקבל תובנה רבה יותר לגבי הדינמיקה והתפקידים של פוספופרוטאינים שונים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית.
Introduction
התפתחות קרניופציאלית של יונקים היא תהליך מורפולוגי מורכב שבמהלכו אוכלוסיות תאים מרובות מתאמות ליצירת השלד הקדמי. בעכבר, תהליך זה מתחיל ביום העוברי (E) 9.5 עם היווצרות הבולטות הקדמית וזוגות של תהליכים מקסילריים ומנדיבולריים, שכל אחד מהם מכיל תאי פסגה עצביים גולגולתיים לאחר נדידה. תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים נובעים מהבולטות הקדמית עם הופעת בורות האף ובסופו של דבר מתמזגים ליצירת הנחיריים. יתר על כן, תהליכי האף המדיאליים והתהליכים המקסילריים מתמזגים ליצירת השפה העליונה. במקביל, palatogenesis הוא יזם עם היווצרות של outgrowths מובהקים – מדפי palatal המשני – מן הצד האוראלי של התהליכים maxillary ב E11.5. עם הזמן, מדפי הפלטה גדלים כלפי מטה משני צדי הלשון, מתרוממים למצב מנוגד מעל הלשון, ובסופו של דבר מתמזגים בקו האמצע ויוצרים חיך רציף המפריד בין חללי האף והפומיה על ידי E16.51.
שינויים מורפולוגיים אלה במהלך ההתפתחות הקרניופציאלית מתחילים ומתקיימים באמצעות אינטראקציות איתות מגוונות, הכוללות לעתים קרובות זרחון חלבונים על ידי קינאזות. לדוגמה, קולטני קרום התא, כגון תת-קבוצות של קולטני β גורם גדילה משתנה (TGF) β, כולל קולטני חלבון מורפוגנטיים של העצם (BMPRs), ומשפחות שונות של קולטנים טירוזין קינאז (RTK), עוברים אוטופוספוריה עם קשירת ליגנד והפעלתם בתאי צמרת עצביים גולגולתיים 2,3,4 . בנוסף, קולטן הטרנס-ממברנה המצומד לחלבון G מוחלק הופך לזרחני בתאי קרסט עצביים גולגולתיים ובאקטודרם קרניופציאלי במורד הזרם של ליגנד הקיפודים של סוניק (SHH) הנקשר לקולטן Patched1, וכתוצאה מכך הצטברות מוחלקה בקרום הציליארי והפעלת מסלול SHH5. אינטראקציות כאלה בין קולטני ליגנד יכולות להתרחש באמצעות איתות אוטוקרין, פרקרין ו/או ג’וקסטקרין בהקשרים קרניופציאליים. לדוגמה, ידוע כי BMP6 מאותת באופן אוטוקריני במהלך התמיינות כונדרוציטים6, בעוד שגורם גדילה פיברובלסט (FGF) 8 מתבטא באקטודרם קשת הלוע ונקשר לחברי משפחת FGF של RTKs המתבטאים בקשת הלוע מזנכימה באופן פאראקריני כדי ליזום דפוסים וצמיחה של קשתות הלוע7, 8,9,10. יתר על כן, איתות Notch מופעל הן בכונדרוציטים והן באוסטאובלסטים במהלך התפתחות השלד הקרניופציאלי באמצעות איתות ג’וקסטקרין כאשר דלתא טרנס-ממברנה ו/או ליגנדות משוננות נקשרות לקולטני חריץ טרנס-ממברנה על תאים שכנים, אשר לאחר מכן נבקעים וזרחנים11. עם זאת, ישנם זוגות אחרים של ליגנד וקולטנים החשובים להתפתחות קרניופציאלית שיש להם את הגמישות לתפקד הן באיתות אוטוקרין והן באיתות פרקרין. לדוגמה, במהלך מורפוגנזה של שן מורין, הודגם כי גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF)-AA ligand מאותת באופן אוטוקריני להפעלת RTK PDGFRα באפיתל איבר האמייל12. לעומת זאת, בתהליכי פנים של מורין במהלך אמצע ההיריון, תעתיקים המקודדים את הליגנדות PDGF-AA ו-PDGF-CC באים לידי ביטוי באקטודרם הקרניופציאלי, בעוד שקולטן ה-PDGFRα מתבטא במזנכים הנגזרים מהפסגה העצבית הגולגולתית הבסיסית, וכתוצאה מכך ה-paracrine מאותת 13,14,15,16,17 . ללא קשר למנגנון האיתות, אירועי זרחון קולטן אלה גורמים לעתים קרובות לגיוס חלבונים מתאמים ו/או מולקולות איתות, שלעתים קרובות הופכים לזרחניים בעצמם כדי ליזום מפלים תוך-תאיים של קינאז כגון מסלול החלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK)18,19.
האפקטים התוך-תאיים הסופיים של מפלים אלה יכולים לאחר מכן לזרחן מערך של מצעים, כגון גורמי שעתוק, חלבוני RNA קושרי RNA, ציטוסקליטים ומטריצות חוץ-תאיות. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25, ו-Sox926 הם בין גורמי השעתוק הזרחניים בהקשר של התפתחות קרניופציאלית. שינוי פוסט-תרגומי זה (PTM) יכול להשפיע ישירות על הרגישות ל-PTMs חלופיים, דימריזציה, יציבות, מחשוף ו/או זיקה לקשירת DNA, בין פעילויות אחרות 20,21,25,26. בנוסף, החלבון קושר ה-RNA Srsf3 עובר זרחון בהקשר של התפתחות קרניופציאלית, מה שמוביל לטרנסלוקציה הגרעיניתשלו 27. באופן כללי, הודגם כי זרחון של חלבונים קושרי RNA משפיע על הלוקליזציה התת-תאית שלהם, על האינטראקציות בין חלבונים לחלבון, על קשירת הרנ”א ו/או על ספציפיות הרצף28. יתר על כן, פוספורילציה של אקטומיוזין יכולה להוביל לסידור מחדש של השלד הציטוסקטלי במהלך התפתחות קרניופציאלית29,30, וזרחון של חלבוני מטריצה חוץ-תאית, כגון גליקופרוטאינים קטנים המקושרים לליגנד N, הקושרים אינטגרין, תורם לביומינרליזציה במהלך התפתחות השלד31. באמצעות הנ”ל ודוגמאות רבות אחרות, ניכר כי קיימות השלכות רחבות על זרחון חלבונים במהלך התפתחות קרניופציאלית. הוספת רמה נוספת של ויסות, פוספורילציה של חלבונים מווסתת עוד יותר על ידי פוספטזות, אשר מנטרלות קינאזות על ידי הסרת קבוצות פוספטים.
אירועי זרחון אלה הן ברמת הקולטן והן ברמת המולקולטור הם קריטיים להפצת מסלולי איתות ובסופו של דבר גורמים לשינויים בביטוי הגנים בגרעין, המניעים פעילויות תאיות ספציפיות, כגון נדידה, התפשטות, הישרדות והתמיינות, המביאות להיווצרות נכונה של פני היונקים. בהתחשב בספציפיות ההקשר של אינטראקציות חלבונים עם קינאזות ופוספטזות, השינויים הנובעים מכך ב-PTMs והשפעתם על פעילות התאים, חשוב מאוד שהפרמטרים האלה ייחקרו בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי להשיג הבנה מלאה של התרומה של אירועי זרחון להתפתחות קרניופציאלית. כאן, מסופקות דוגמאות לשני הקשרים שבהם ניתן לחקור זרחון של חלבונים, ולפיכך, הפעלה של מסלולי איתות במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים: תהליכי פנים של עכברים, במיוחד תהליכים מקסילריים E11.5, ותאי מזנכים עובריים של עכברים מתורבתים שמקורם במדפים פאלטליים משניים E13.5 – הן ראשוניים32 והןמונצחים 33 . ב- E11.5, התהליכים המקסילריים נמצאים בתהליך של התמזגות עם תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים1, ובכך מייצגים נקודת זמן קריטית במהלך התפתחות קרניופציאלית של עכבר. יתר על כן, תהליכים מקסילריים ותאים שמקורם במדפי הפלטה נבחרו כאן מכיוון שהמבנים האחרונים הם נגזרות של הראשונים, ובכך מספקים לחוקרים את ההזדמנות לחקור את זרחון החלבון in vivo ו – in vitro בהקשרים קשורים. עם זאת, פרוטוקול זה חל גם על תהליכי פנים חלופיים ונקודות זמן התפתחותיות.
בעיה קריטית בחקר חלבונים זרחניים היא שהם עוברים דה-פוספורילציה בקלות במהלך בידוד חלבונים על-ידי שפע של פוספטזות סביבתיות. כדי להתגבר על מחסום זה, נדונים התאמות ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטיות המאפשרות בידוד של חלבונים זרחניים. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות מסופקות לניתוח נכון וכימות של חלבונים זרחניים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה, במיוחד בשילוב עם מעכבים פרמקולוגיים ו/או מודלים גנטיים של מורין, כדי לקבל תובנה רבה יותר לגבי הדינמיקה והתפקידים של מסלולי איתות שונים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרים לחקור אירועי איתות קריטיים התלויים בזרחון במהלך התפתחות קרניופציאלית באופן חזק וניתן לשחזור. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה המבטיחים איסוף נכון של נתונים וניתוח תוצאות. בין אם מבודדים פוספופרוטאינים מתהליכי פנים של עכברים ו/או מתאי מזנכים פאלטל?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
129S4 עכברים היו מתנה מד”ר פיליפ סוריאנו, בית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני. עבודה זו נתמכה בכספים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)/המכון הלאומי למחקר דנטלי וקרניופציאלי (NIDCR) R01 DE027689 ו- K02 DE028572 ל- K.A.F., F31 DE029976 ל- M.A.R. ו- F31 DE029364 ל- B.J.C.D.
Materials
| Equipment | |||
| Block for mini dry bath | Research Products International Corp | 400783 | |
| ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software | Bio-Rad | 1708265 | chemiluminescence imager |
| CO2 incubator, air jacket | VWR | 10810-902 | |
| Dissecting board, 11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module | Bio-Rad | 1658030 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini dry bath | Research Products International Corp | 400780 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | |
| pH meter | VWR | 89231-662 | |
| Power supply for SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Rectangular ice pan, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light | Zeiss | 4350649020000000 | dissecting microscope |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Tube revolver | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Water bath | VWR | 89501-472 | |
| Western blot box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materials | |||
| Cell culture dishes, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Cell culture plates, 12 well | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Cell lifters | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Conical tubes, polypropylene, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Embryo spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pasteur pipet, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteur pipet, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Petri dishes, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Pouches, transparent, polyethylene lining | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF membrane | Fisher Scientific | IPVH00010 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Small latex bulb, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Syringe with luer tip, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Western blot cassette opening lever | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr chromatography paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagents | |||
| 4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G5422-25G | stock concentration 1 M |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | AC403140050 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 11836153001 | stock concentration 25x |
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL | Developmental Studies Hybridoma Bank | E7 | 1:1,000 |
| ECL western blotting substrate | Fisher Scientific | PI32106 | low picogram range |
| ECL western blotting substrate | Genesee Scientific | 20-302B | low femtogram range |
| Electrophoresis buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | stock concentration 10x |
| Ethanol, 200 proof, 1 gallon | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glycerol (certified ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20,000 |
| Hydrochloric acid solution, 6N (certified) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca – 630 non-ionic detergent | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | stock concentration 200 mM |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1,000; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB recombinant ligand, rat | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1,000 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; stock concentration 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1,000 |
| Potassium chloride (white crystals) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic (white crystals) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solution, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Sodium chloride (crystalline/biological,certified) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Sodium fluoride (powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M |
| Sodium orthovanadate, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; stock concentration 100 mM |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Tissue culture PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Transfer buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | stock concentration 10x |
| Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western blot molecular weight marker | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 mice | gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
- Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Biologie du développement. 415 (2), 198-215 (2016).
- Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
- MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
- Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
- Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
- Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
- Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
- Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
- Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
- Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
- Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
- Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
- Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
- Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
- Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
- Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
- Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
- Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
- Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
- Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
- Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
- Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , (2022).
- . Analyzing gels and western blots with ImageJ Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010)
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
- Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
- Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
- Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Biologie du développement. 426 (1), 97-114 (2017).
- Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
- Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
- Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).
