تحضير العصب الوركي للفئران للفسيولوجيا العصبية خارج الجسم الحي
Summary
يصف هذا البروتوكول تحضير الأنسجة العصبية الوركية الكاملة للفئران للتحفيز الكهروفسيولوجي خارج الجسم الحي وتسجيلها في حمام ملحي منظم بيئيا ومكون من مقصورتين.
Abstract
تمكن المستحضرات خارج الجسم الحي من دراسة العديد من العمليات العصبية الفسيولوجية بمعزل عن بقية الجسم مع الحفاظ على بنية الأنسجة المحلية. يصف هذا العمل تحضير الأعصاب الوركية للفئران للفسيولوجيا العصبية خارج الجسم الحي ، بما في ذلك إعداد المخزن المؤقت ، والإجراءات الحيوانية ، وإعداد المعدات ، والتسجيل الفسيولوجي العصبي. يقدم هذا العمل نظرة عامة على الأنواع المختلفة من التجارب الممكنة باستخدام هذه الطريقة. تهدف الطريقة المحددة إلى توفير 6 ساعات من التحفيز والتسجيل على الأنسجة العصبية الطرفية المستخرجة في ظروف خاضعة لرقابة مشددة لتحقيق الاتساق الأمثل في النتائج. النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة هي إمكانات العمل المركب من الألياف A (CAP) مع سعات من الذروة إلى الذروة في نطاق المللي فولت طوال مدة التجربة. إن سعات وأشكال CAP متسقة وموثوقة ، مما يجعلها مفيدة لاختبار ومقارنة الأقطاب الكهربائية الجديدة بالنماذج الحالية ، أو آثار التدخلات على الأنسجة ، مثل استخدام المواد الكيميائية أو التعديلات الجراحية أو تقنيات التحفيز العصبي. تم اختبار كل من أقطاب الكفة التقليدية المتاحة تجاريا مع ملامسات البلاتين والإيريديوم وأقطاب المطاط الصناعي الموصلة حسب الطلب وأعطت نتائج مماثلة من حيث الاستجابة لقوة التحفيز العصبي ومدة المدة.
Introduction
إن الفهم الحالي لوظيفة الأعصاب الأساسية كما هو موضح في silico يفتقر إلى عدة جوانب ، لا سيما فيما يتعلق بآثار تفتيت الأنسجة العصبية خارج السوما والمحور العصبي والتشعبات. لا تزال التفاعلات بين المحور العصبي والمايلين غير مفهومة بشكل جيد كما يتضح من حقيقة أنه حتى نماذج الأعصاب الحسابية التفصيلية مثل MRG1 (لأعصاب الثدييات) التي تلتقط بشكل كاف استجابة التحفيز الكهربائي التقليدية ، لا تلتقط السلوكيات الأخرى المرصودة تجريبيا مثل ترحيل الكتلة عالية التردد2 أو استجابة البداية الثانوية3.
يوفر هذا البروتوكول طريقة للتحقيق بكفاءة في العمليات الفسيولوجية العصبية على مستوى الأعصاب في نموذج حيواني مختبري صغير حاد ، باستخدام بروتوكول إعداد موحد لعزل العصب ، والتحكم في بيئته ، وإزالته من سياق في الجسم الحي إلى سياق خارج الجسم الحي. هذا سيمنع عمليات الجسم الأخرى أو التخدير المستخدم من قبل بروتوكولات تحفيز الأعصاب في الجسم الحي لتغيير سلوك الأعصاب وإرباك النتائج المقاسة أو تفسيرها 4,5. وهذا يمكن من تطوير نماذج أكثر واقعية تركز فقط على التأثيرات الخاصة بالأنسجة العصبية غير المفهومة بشكل جيد. هذا البروتوكول مفيد أيضا كمنصة اختبار لتحفيز الأعصاب الجديدة وتسجيل مواد القطب الكهربائي وهندسته ، بالإضافة إلى نماذج التحفيز الجديدة مثل الكتلة عالية التردد 2,3. تم استخدام اختلافات في هذه التقنية سابقا لدراسة فسيولوجيا الأعصاب في ظروف خاضعة لرقابة مشددة6 ، على سبيل المثال ، لقياس ديناميكيات وخصائص القناة الأيونية أو آثار التخدير الموضعي7.
توفر هذه التقنية العديد من المزايا مقارنة بالبدائل مثل التجارب الحادة في الجسم الحي على الحيوانات الصغيرة8. تغني هذه التقنية عن الحاجة إلى الحفاظ على عمق التخدير حيث تم استخراج الأنسجة من الجسم ، مما يقلل من كمية المعدات المطلوبة مثل ناشر مخدر ، ومكثف الأكسجين ، ووسادة التدفئة. هذا يبسط البروتوكول التجريبي ، مما يقلل من خطر الأخطاء. نظرا لأن التخدير يمكن أن يغير وظيفة الأعصاب4 ، فإن هذه التقنية تضمن عدم الخلط بين التدابير بسبب الآثار الجانبية لهذه المركبات المخدرة. وأخيرا ، هذه التقنية أكثر ملاءمة من التجارب الحادة في الجسم الحي عند دراسة آثار المركبات السامة للأعصاب مثل التيترودوتوكسين ، والتي من شأنها أن تقتل حيوانا مخدرا عن طريق الشلل.
أقسام الأعصاب المحيطية هي نظام فريد من نوعه خارج الجسم الحي لأن هناك فرصة كبيرة لأن الألياف المسؤولة عن الإشارات العصبية المسجلة لا تحتوي على أي سوما. وبما أن هذه الخلايا عادة ما تكون موجودة ، بالنسبة للخلايا العصبية الحركية ، في العمود الفقري ، وللخلايا العصبية الحسية في العقد الجذرية الظهرية بجوار العمود الفقري ، يمكن نمذجة إعداد جزء من عصب الثدييات تقريبا كمجموعة من الأغشية الأنبوبية ذات القنوات الأيونية ، المفتوحة في كلا الطرفين9. يتم الحفاظ على التمثيل الغذائي بواسطة الميتوكوندريا الموجودة في المحور العصبي في وقت تشريح الأنسجة10. يتم تشجيع خياطة الأطراف المفتوحة للمحور بعد الاستخراج لإغلاقها وبالتالي المساعدة في الحفاظ على التدرجات الأيونية الموجودة عبر الغشاء ، والتي تعتبر ضرورية لوظيفة الأعصاب الطبيعية.
للحفاظ على توازن الأنسجة خارج الجسم ، يجب التحكم في العديد من المتغيرات البيئية بإحكام. هذه هي درجة الحرارة11 ، الأوكسجين 12 ، الأسمولية ، الرقم الهيدروجيني13,14 ، والوصول إلى الجلوكوز للحفاظ على التمثيل الغذائي. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتمثل النهج في استخدام مخزن مؤقت معدل Krebs-Henseleit15,16 (mKHB) يتم تهويته باستمرار بمزيج من الأكسجين وثاني أكسيد الكربون. يقع mKHB في عائلة المخازن المؤقتة القلبية 6,17 المستخدمة للحفاظ على الأنسجة المشرطة خارج الجسم ، على سبيل المثال ، في التجارب خارج الجسم الحي. لا تحتوي هذه المخازن المؤقتة على أي هيموغلوبين أو مضادات حيوية أو مضادات للفطريات ، وبالتالي فهي مناسبة فقط للمستحضرات التي تنطوي على كميات صغيرة من الأنسجة لفترة محدودة. تم تحقيق التحكم في الأس الهيدروجيني باستخدام زوج الأكسدة والاختزال الكربوني وثاني أكسيد الكربون ، مما يتطلب تهوية مستمرة للمخزن المؤقت مع ثاني أكسيد الكربون للحفاظ على توازن الأس الهيدروجيني. هذا لتجنب استخدام عوامل التخزين المؤقت الشائعة الأخرى مثل HEPES ، والتي يمكن أن تعدل وظيفة الخلايا العصبية18. لأكسجة المخزن المؤقت وتوفير التحكم في درجة الحموضة ، تم استخدام خليط من 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في الأكسجين يسمى carbogen (95٪ O 2 ، 5٪ CO2). تم استخدام محرك تسخين للتحكم في درجة حرارة حاوية عازلة ، وتم تشغيل المخزن المؤقت من خلال حمام عصبي ، ثم أعيد تدويره إلى حاوية البداية. تستمر التجربة النموذجية من 6 إلى 8 ساعات قبل أن يفقد العصب قدرته على البقاء ولم يعد يستجيب بما فيه الكفاية للتحفيز لاتخاذ تدابير تمثل الأنسجة السليمة.
لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، تم استخدام أقطاب كلوريد الفضة للتسجيل ، والتي تم إعدادها وفقا للطرق الموصوفة سابقا19. للتحفيز ، يمكن استخدام مزيج من أقطاب الكفة البلاتينية التجارية الجاهزة وأقطاب الكفة البوليمرية الموصلة حسب الطلب. تتمتع أقطاب الكفة البوليمرية الموصلة بقدرات شحن أعلى بشكل ملحوظ ، وهي مفيدة عند تحفيز العصب باستخدام الأشكال الموجية عالية السعة20.
تم وصف المحفز المستخدم في هذا البروتوكول سابقا20. الوثائق وملفات التصميم والبرامج النصية لاستخدامها متاحة للجمهور21. يمكن استخدام محفزات أخرى لتنفيذ هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن المحفز المخصص قادر أيضا على كتلة التيار البديل عالي التردد (HFAC) 2,20 ، والتي تمكن مجموعة واسعة من تجارب الفيزيولوجيا العصبية. لاستخدام كتلة HFAC ، يوصى باستخدام أساور مطاطية موصلة لتجنب تلف العصب. الأصفاد العصبية المطاطية الموصلة هي صفائف قطب كهربائية ناعمة وبوليمرية بالكامل يتم إنتاجها من اللدائن الموصلة كمكون موصل و polydimethylsiloxane كعازل22. تم تصنيع الأجهزة في تكوين ثنائي القطب باستخدام تقنيات التصنيع الدقيق بالليزر التقليدية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل ، وصفنا بروتوكولا لإعداد الأعصاب الوركية للفئران للفسيولوجيا العصبية خارج الجسم الحي. يستغرق استخراج الأنسجة حوالي 30 دقيقة ، بما في ذلك التعامل مع الحيوانات والتخدير والإعدام والتشريح ، في حين يجب أن يتطلب تنظيف الأعصاب ووضعها في الحمام وزرع القطب الكهربائي 30 دقيقة إضا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بالدكتور جيرالد هونسبيرجر من شركة جلاكسو سميث كلاين للأدوية ، ملك بروسيا ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، وغالفاني للإلكترونيات الحيوية (ستيفناج ، المملكة المتحدة) لمشاركة تقنية تحضير الأعصاب الأصلية معنا. يعترف المؤلفون روبرت توث بتصميم حمام الأعصاب ثنائي الغرفة. يعترف المؤلفون بالتمويل المقدم من منحة جوائز تحدي تقنيات الرعاية الصحية (HTCA) من مجلس أبحاث الهندسة والعلوم الفيزيائية (EPSRC). يعترف المؤلفون بمركز الأنظمة المدمجة والموزعة عالية الأداء للتدريب على الدكتوراه (HiPEDS CDT) التابع لإمبريال كوليدج لندن لتمويل أدريان رابو (EP / L016796/1 ). يتم تمويل Adrien Rapeaux حاليا من قبل معهد أبحاث الخرف في المملكة المتحدة ومركز أبحاث الرعاية والتكنولوجيا. يعترف المؤلفون بامتنان بزاك بيلي من إمبريال كوليدج ، في قسم الهندسة الحيوية ، للمساعدة في التجارب والوصول إلى الأنسجة الحيوانية أثناء إنتاج مقال فيديو JoVE.
Materials
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. Acid-base homeostasis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021)
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
