Forberedelse af rotte iskiasnerve til Ex Vivo neurofysiologi
Summary
Denne protokol beskriver fremstillingen af hele iskiasnervevæv hos rotter til ex vivo elektrofysiologisk stimulering og registrering i et miljøreguleret, to-rums perfunderet saltvandsbad.
Abstract
Ex vivo-præparater gør det muligt at studere mange neurofysiologiske processer isoleret fra resten af kroppen, samtidig med at den lokale vævsstruktur bevares. Dette arbejde beskriver forberedelsen af rotte iskiasnerver til ex vivo neurofysiologi, herunder bufferforberedelse, dyreprocedurer, opsætning af udstyr og neurofysiologisk registrering. Dette arbejde giver et overblik over de forskellige typer eksperimenter, der er mulige med denne metode. Den skitserede metode sigter mod at tilvejebringe 6 timers stimulering og registrering på ekstraheret perifert nervevæv under tæt kontrollerede forhold for optimal konsistens i resultaterne. Resultater opnået ved hjælp af denne metode er A-fiber sammensatte aktionspotentialer (CAP) med peak-to-peak amplituder i millivoltområdet over hele eksperimentets varighed. CAP-amplituder og former er konsistente og pålidelige, hvilket gør dem nyttige til at teste og sammenligne nye elektroder med eksisterende modeller eller virkningerne af interventioner på vævet, såsom brugen af kemikalier, kirurgiske ændringer eller neuromodulerende stimuleringsteknikker. Både konventionelle kommercielt tilgængelige manchetelektroder med platin-iridiumkontakter og specialfremstillede ledende elastomerelektroder blev testet og gav lignende resultater med hensyn til nervestimuleringsstyrke-varighedsrespons.
Introduction
Den nuværende forståelse af grundlæggende nervefunktion som modelleret i silico mangler i flere aspekter, især med hensyn til virkningerne af nervevævsopdeling uden for soma, axon og dendritter. Axon-myelin-interaktioner forstås stadig dårligt som det fremgår af det faktum, at selv detaljerede beregningsnervemodeller såsom MRG1 (for pattedyrnerver), der tilstrækkeligt fanger konventionel elektrisk stimuleringsrespons, ikke fanger andre eksperimentelt observerede adfærd såsom højfrekvent blokoverførsel2 eller sekundær debutrespons3.
Denne protokol giver en metode til effektivt at undersøge neurofysiologiske processer på nerveniveau i en akut lille laboratoriedyrsmodel ved hjælp af en standardiseret forberedelsesprotokol til at isolere nerven, kontrollere dens miljø og fjerne den fra en in vivo-sammenhæng til en ex vivo-sammenhæng. Dette vil forhindre andre kropsprocesser eller anæstetika, der anvendes af in vivo nervestimuleringsprotokoller til at ændre nerveadfærd og forvirre målte resultater eller deres fortolkning 4,5. Dette muliggør udvikling af mere realistiske modeller, der udelukkende fokuserer på effekter, der er specifikke for nervevæv, der er dårligt forstået. Denne protokol er også nyttig som testbed til ny nervestimulering og registrering af elektrodematerialer og geometrier samt nye stimuleringsparadigmer såsom højfrekvent blok 2,3. Variationer af denne teknik er tidligere blevet brugt til at studere nervefysiologi under tæt kontrollerede forhold6, for eksempel til at måle ionkanaldynamik og egenskaber eller virkningerne af lokalbedøvelsesmidler7.
Denne teknik giver flere fordele sammenlignet med alternativer såsom akutte in vivo små dyreforsøg8. Teknikken undgår behovet for at opretholde anæstesidybden, da vævet er ekstraheret fra kroppen, hvilket reducerer mængden af nødvendigt udstyr såsom en bedøvelsesdiffusor, iltkoncentrator og varmepude. Dette forenkler den eksperimentelle protokol, hvilket reducerer risikoen for fejl. Da anæstetika potentielt kan ændre nervefunktion4, sikrer denne teknik, at målinger ikke vil blive forvirret af bivirkninger fra disse bedøvelsesforbindelser. Endelig er denne teknik mere hensigtsmæssig end akutte in vivo-eksperimenter , når man studerer virkningerne af neurotoksiske forbindelser, såsom tetrodotoxin, som ville dræbe et bedøvet dyr ved lammelse.
Perifere nerveafsnit er et unikt ex vivo-system , da der er stor chance for, at fibrene, der er ansvarlige for registrerede neurale signaler, ikke indeholder nogen soma. Da disse normalt ville være placeret, for motorneuroner, i rygsøjlen og for sensoriske neuroner i de dorsale rodganglier ved siden af rygsøjlen, kan forberedelsen af en sektion af pattedyrnerven groft modelleres som en samling rørformede membraner med ionkanaler, åbne i begge ender9. Metabolisme opretholdes af mitokondrierne placeret i axonen på tidspunktet for vævsdissektion10. Suturering af de åbne ender af axolemmaet tilskyndes efter ekstraktion til at lukke dem og derved hjælpe med at opretholde eksisterende ioniske gradienter over membranen, som er afgørende for normal nervefunktion.
For at opretholde vævshomeostase uden for kroppen skal flere miljøvariabler kontrolleres tæt. Disse er temperatur11, iltning12, osmolaritet, pH13,14 og adgang til glukose for at opretholde stofskiftet. Til denne protokol er fremgangsmåden at anvende en modificeret Krebs-Henseleit-buffer 15,16 (mKHB) kontinuerligt luftet med en blanding af ilt og kuldioxid. mKHB er i familien af kardioplegiske buffere 6,17, der bruges til at bevare dissekerede væv uden for kroppen, for eksempel i ex vivo-eksperimenter. Disse buffere indeholder ikke hæmoglobin, antibiotika eller svampemidler og er derfor kun egnede til præparater, der involverer små mængder væv i en begrænset periode. pH-kontrol blev opnået med carboncarbonat- og kuldioxidredoxparret, hvilket krævede konstant beluftning af bufferen med kuldioxid for at opretholde pH-ligevægt. Dette er for at undgå at bruge andre almindelige buffermidler såsom HEPES, som kan ændre nervecellefunktionen18. For at ilte bufferen og tilvejebringe pH-kontrol blev der anvendt en blanding af 5% kuldioxid i ilt kaldet carbogen (95%O2, 5% CO2). En varmeomrører blev brugt til temperaturregulering af en bufferbeholder, og bufferen blev perfunderet gennem et nervebad og derefter recirkuleret til startbeholderen. Et typisk eksperiment ville vare 6-8 timer, før nerven mister sin levedygtighed og ikke længere reagerer tilstrækkeligt på stimulering til, at foranstaltninger er repræsentative for sundt væv.
For at optimere signal-støj-forholdet blev sølvchloridelektroder anvendt til optagelse, som blev fremstillet i henhold til tidligere beskrevne metoder19. Til stimulering kan en kombination af kommercielle off-the-shelf platin manchetelektroder og specialfremstillede ledende polymer manchetelektroder anvendes. Ledende polymermanchetelektroder har markant højere ladningskapacitet, hvilket er nyttigt, når nerven stimuleres ved hjælp af bølgeformer med høj amplitude20.
Stimulatoren, der anvendes i denne protokol, er tidligere beskrevet20. Dokumentation, designfiler og softwarescripts til brug er offentligt tilgængelige21. Andre stimulatorer kan bruges til at udføre denne protokol; den brugerdefinerede stimulator er imidlertid også i stand til højfrekvent alternativ strøm (HFAC) blok 2,20, hvilket muliggør et bredere udvalg af neurofysiologiske eksperimenter. For at bruge HFAC-blok anbefales ledende elastomermanchetter for at undgå skade på nerven. Ledende elastomernervemanchetter er bløde og fuldt polymere elektrodearrays fremstillet af ledende elastomerer som den ledende komponent og polydimethylsiloxan som isoleringen22. Enheder blev fremstillet i en bipolar konfiguration ved hjælp af konventionelle lasermikrofabrikationsteknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbejde beskrev vi en protokol til forberedelse af rotte iskiasnerver til ex vivo neurofysiologi. Vævsekstraktion tager cirka 30 minutter, inklusive dyrehåndtering, anæstesi, aflivning og dissektion, mens nerverensning, placering i badet og elektrodeimplantation bør kræve yderligere 30 minutter, før optagelsen kan startes. Bufferforberedelse kan udføres på 30 minutter, selvom dette kan gøres forud for resten af eksperimentet. Denne type præparat og forsøg er blevet anvendt og beskrevet i de se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Dr. Gerald Hunsberger fra GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, USA og Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK) for at dele deres originale nerveforberedelsesteknik med os. Forfatterne anerkender Robert Toth for dual-chamber nervebaddesignet. Forfatterne anerkender finansiering fra Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) bevilling fra Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). Forfatterne anerkender High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) fra Imperial College London for finansiering af Adrien Rapeaux (EP / L016796/1 ). Adrien Rapeaux er i øjeblikket finansieret af UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Forfatterne anerkender taknemmeligt Zack Bailey fra Imperial College, i Institut for Bioengineering, for hjælp med eksperimenter og adgang til animalsk væv under produktionen af JoVE-videoartiklen.
Materials
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. Acid-base homeostasis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021)
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
