पूर्व विवो न्यूरोफिजियोलॉजी के लिए चूहे कटिस्नायुशूल तंत्रिका की तैयारी
Summary
यह प्रोटोकॉल पूर्व विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल उत्तेजना के लिए चूहे पूरे कटिस्नायुशूल तंत्रिका ऊतक की तैयारी और पर्यावरण-विनियमित, दो-डिब्बे, सुगंधित खारा स्नान में रिकॉर्डिंग का वर्णन करता है।
Abstract
पूर्व विवो तैयारी स्थानीय ऊतक संरचना को संरक्षित करते हुए शरीर के बाकी हिस्सों से अलगाव में कई न्यूरोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम करती है। यह काम पूर्व विवो न्यूरोफिजियोलॉजी के लिए चूहे कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं की तैयारी का वर्णन करता है, जिसमें बफर तैयारी, पशु प्रक्रियाएं, उपकरण सेटअप और न्यूरोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग शामिल हैं। यह काम इस पद्धति के साथ संभव विभिन्न प्रकार के प्रयोगों का अवलोकन प्रदान करता है। उल्लिखित विधि का उद्देश्य परिणामों में इष्टतम स्थिरता के लिए कसकर नियंत्रित स्थितियों में निकाले गए परिधीय तंत्रिका ऊतक पर उत्तेजना और रिकॉर्डिंग के 6 घंटे प्रदान करना है। इस पद्धति का उपयोग करके प्राप्त परिणाम प्रयोग की पूरी अवधि में मिलीवोल्ट रेंज में पीक-टू-पीक आयाम के साथ ए-फाइबर कंपाउंड एक्शन पोटेंशिअल (सीएपी) हैं। सीएपी आयाम और आकार सुसंगत और विश्वसनीय हैं, जिससे उन्हें मौजूदा मॉडलों के लिए नए इलेक्ट्रोड का परीक्षण और तुलना करने के लिए उपयोगी बनाया जाता है, या ऊतक पर हस्तक्षेप के प्रभाव, जैसे रसायनों, सर्जिकल परिवर्तन, या न्यूरोमोडुलेटरी उत्तेजना तकनीकों का उपयोग। प्लैटिनम-इरिडियम संपर्कों और कस्टम-निर्मित प्रवाहकीय इलास्टोमर इलेक्ट्रोड के साथ पारंपरिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कफ इलेक्ट्रोड दोनों का परीक्षण किया गया और तंत्रिका उत्तेजना शक्ति-अवधि प्रतिक्रिया के संदर्भ में समान परिणाम दिए गए।
Introduction
सिलिको में मॉडलिंग के रूप में मौलिक तंत्रिका समारोह की वर्तमान समझ में कई पहलुओं की कमी है, विशेष रूप से सोमा, अक्षतंतु और डेंड्राइट्स के बाहर तंत्रिका ऊतक विभाजन के प्रभावों के संबंध में। एक्सोन-माइलिन इंटरैक्शन को अभी भी इस तथ्य से स्पष्ट रूप से समझा जाता है कि यहां तक कि विस्तृत कम्प्यूटेशनल तंत्रिका मॉडल जैसे एमआरजी1 (स्तनधारी नसों के लिए) जो पारंपरिक विद्युत उत्तेजना प्रतिक्रिया को पर्याप्त रूप से कैप्चर करते हैं, अन्य प्रयोगात्मक रूप से देखे गए व्यवहारों को कैप्चर नहीं करते हैं जैसे कि उच्च आवृत्ति ब्लॉक कैरीओवर2 या माध्यमिक शुरुआत प्रतिक्रिया3.
यह प्रोटोकॉल तंत्रिका को अलग करने, अपने पर्यावरण को नियंत्रित करने और इसे पूर्व विवो संदर्भ में विवो संदर्भ से हटाने के लिए एक मानकीकृत तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग करके, एक तीव्र छोटे प्रयोगशाला पशु मॉडल में तंत्रिका स्तर पर न्यूरोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं की कुशलतापूर्वक जांच करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। यह तंत्रिका व्यवहार को बदलने और मापा परिणाम या उनकी व्याख्या 4,5 को बदलने के लिए विवो तंत्रिका उत्तेजना प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली अन्य शरीर प्रक्रियाओं या संवेदनाहारी को रोक देगा। यह तंत्रिका ऊतकों के लिए विशिष्ट प्रभावों पर पूरी तरह से ध्यान केंद्रित करने वाले अधिक यथार्थवादी मॉडल के विकास को सक्षम बनाता है जो खराब समझे जाते हैं। यह प्रोटोकॉल नई तंत्रिका उत्तेजना और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सामग्री और ज्यामिति के साथ-साथ उच्च आवृत्ति ब्लॉक 2,3 जैसे नए उत्तेजना प्रतिमानों के लिए एक टेस्टबेड के रूप में भी उपयोगी है। इस तकनीक की विविधताओं का उपयोग पहले कसकर नियंत्रित स्थितियों में तंत्रिका शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया गया है6, उदाहरण के लिए, आयन चैनल गतिशीलता और गुणों या स्थानीय संवेदनाहारी केप्रभावों को मापने के लिए 7.
यह तकनीक विवो छोटे पशु प्रयोग8 में तीव्र जैसे विकल्पों की तुलना में कई फायदे प्रदान करती है। तकनीक संज्ञाहरण गहराई को बनाए रखने की आवश्यकता को कम करती है क्योंकि ऊतक शरीर से निकाला गया है, जिससे एनेस्थेटिक विसारक, ऑक्सीजन कंसंट्रेटर और हीटिंग पैड जैसे आवश्यक उपकरणों की मात्रा कम हो जाती है। यह प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को सरल बनाता है, गलतियों के जोखिम को कम करता है। चूंकि एनेस्थेटिक्स संभावित रूप से तंत्रिका समारोह4 को बदल सकता है, यह तकनीक यह सुनिश्चित करती है कि उपाय इन संवेदनाहारी यौगिकों से दुष्प्रभावों से भ्रमित नहीं होंगे। अंत में, यह तकनीक टेट्रोडोटॉक्सिन जैसे न्यूरोटॉक्सिक यौगिकों के प्रभावों का अध्ययन करते समय विवो प्रयोगों में तीव्र की तुलना में अधिक उपयुक्त है, जो पक्षाघात द्वारा एक संवेदनाहारी जानवर को मार देगा।
परिधीय तंत्रिका अनुभाग एक अद्वितीय पूर्व विवो प्रणाली हैं क्योंकि एक उच्च संभावना है कि रिकॉर्ड किए गए तंत्रिका संकेतों के लिए जिम्मेदार फाइबर में कोई सोमा नहीं होता है। जैसा कि ये सामान्य रूप से स्थित होंगे, मोटर न्यूरॉन्स के लिए, रीढ़ की हड्डी में, और रीढ़ के बगल में पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया में संवेदी न्यूरॉन्स के लिए, स्तनधारी तंत्रिका के एक खंड की तैयारी को मोटे तौर पर आयन चैनलों के साथ ट्यूबलर झिल्ली के संग्रह के रूप में मॉडलिंग किया जा सकता है, दोनों सिरों पर खुला9. ऊतक विच्छेदन10 के समय अक्षतंतु में स्थित माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा चयापचय बनाए रखा जाता है। एक्सोलेम्मा के खुले सिरों को बंद करने के लिए निष्कर्षण के बाद प्रोत्साहित किया जाता है और इस तरह झिल्ली में मौजूदा आयनिक ढाल को बनाए रखने में मदद मिलती है, जो सामान्य तंत्रिका कार्य के लिए आवश्यक हैं।
शरीर के बाहर ऊतक होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए, कई पर्यावरणीय चर को कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए। ये तापमान11,ऑक्सीजनेशन 12, ऑस्मोलरिटी, पीएच13,14 और चयापचय को बनाए रखने के लिए ग्लूकोज तक पहुंच हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, दृष्टिकोण ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड के मिश्रण के साथ लगातार वातित एक संशोधित क्रेब्स-हेन्सेलाइट बफर 15,16 (एमकेएचबी) का उपयोग करना है। एमकेएचबी कार्डियोप्लेजिक बफर 6,17 के परिवार में है जिसका उपयोग शरीर के बाहर विच्छेदित ऊतकों को संरक्षित करने के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए, पूर्व विवो प्रयोगों में। इन बफर में कोई हीमोग्लोबिन, एंटीबायोटिक्स या एंटिफंगल नहीं होते हैं और इसलिए, केवल सीमित समय के लिए ऊतक की थोड़ी मात्रा से जुड़ी तैयारी के लिए उपयुक्त होते हैं। पीएच नियंत्रण कार्बोनेट और कार्बन डाइऑक्साइड रेडॉक्स जोड़ी के साथ प्राप्त किया गया था, पीएच संतुलन बनाए रखने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के साथ बफर के निरंतर वातन की आवश्यकता होती है। यह एचईपीईएस जैसे अन्य सामान्य बफरिंग एजेंटों का उपयोग करने से बचने के लिए है, जो तंत्रिका कोशिका समारोह18 को संशोधित कर सकते हैं। बफर को ऑक्सीजन देने और पीएच नियंत्रण प्रदान करने के लिए, कार्बोजन (95% ओ 2, 5% सीओ 2) नामक ऑक्सीजन में 5% कार्बन डाइऑक्साइड के मिश्रण का उपयोग किया गया था। एक हीटिंग उत्तेजक का उपयोग एक बफर कंटेनर के तापमान नियंत्रण के लिए किया गया था, और बफर को तंत्रिका स्नान के माध्यम से सुगंधित किया गया था, और फिर शुरुआती कंटेनर में फिर से परिचालित किया गया था। तंत्रिका अपनी व्यवहार्यता खोने से पहले एक विशिष्ट प्रयोग 6-8 घंटे तक चलेगा और अब स्वस्थ ऊतक के प्रतिनिधि होने के उपायों के लिए उत्तेजना के लिए पर्याप्त प्रतिक्रिया नहीं देता है।
सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अनुकूलित करने के लिए, रिकॉर्डिंग के लिए सिल्वर-क्लोराइड इलेक्ट्रोड का उपयोग किया गया था, जो पहले वर्णित विधियों19 के अनुसार तैयार किए गए थे। उत्तेजना के लिए, वाणिज्यिक ऑफ-द-शेल्फ प्लैटिनम कफ इलेक्ट्रोड और कस्टम-निर्मित प्रवाहकीय बहुलक कफ इलेक्ट्रोड के संयोजन का उपयोग किया जा सकता है। प्रवाहकीय बहुलक कफ इलेक्ट्रोड में विशेष रूप से उच्च चार्ज क्षमता होती है, जो उच्च आयाम तरंगों का उपयोग करके तंत्रिका को उत्तेजित करते समय उपयोगीहोती है 20.
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उत्तेजक को पहले20 वर्णित किया गया है। प्रलेखन, डिजाइन फ़ाइलें, और सॉफ्टवेयर स्क्रिप्ट इसका उपयोग करने के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं21. इस प्रोटोकॉल को निष्पादित करने के लिए अन्य उत्तेजक का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, कस्टम उत्तेजक उच्च आवृत्ति वैकल्पिक वर्तमान (एचएफएसी) ब्लॉक2,20 में भी सक्षम है, जो न्यूरोफिजियोलॉजी प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला को सक्षम बनाता है। एचएफएसी ब्लॉक का उपयोग करने के लिए, तंत्रिका को नुकसान से बचने के लिए प्रवाहकीय इलास्टोमर कफ की सिफारिश की जाती है। प्रवाहकीय इलास्टोमर तंत्रिका कफ नरम और पूरी तरह से बहुलक इलेक्ट्रोड सरणियों हैं जो प्रवाहकीय इलास्टोमर्स से प्रवाहकीय घटक के रूप में और पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन इन्सुलेशन22 के रूप में उत्पन्न होते हैं। पारंपरिक लेजर माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों का उपयोग करके एक द्विध्रुवी कॉन्फ़िगरेशन में उपकरणों का निर्माण किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में, हमने पूर्व विवो न्यूरोफिजियोलॉजी के लिए चूहे कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। ऊतक निष्कर्षण में लगभग 30 मिनट लगते हैं, जिसमें पशु हैंडलिंग, संज्ञ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन फार्मास्यूटिकल्स के डॉ गेराल्ड हंसबर्गर, प्रशिया के राजा, पीए, यूएसए और गैल्वानी बायोइलेक्ट्रॉनिक्स (स्टीवनेज, यूके) को हमारे साथ अपनी मूल तंत्रिका तैयारी तकनीक साझा करने के लिए स्वीकार करते हैं। लेखक दोहरे चैंबर तंत्रिका स्नान डिजाइन के लिए रॉबर्ट टोथ को स्वीकार करते हैं। लेखक इंजीनियरिंग और भौतिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (ईपीएसआरसी) के हेल्थकेयर टेक्नोलॉजीज चैलेंज अवार्ड्स (एचटीसीए) अनुदान से धन स्वीकार करते हैं। लेखक एड्रियन रेपॉक्स (ईपी / एल 016796/1) के वित्तपोषण के लिए इंपीरियल कॉलेज लंदन के डॉक्टरेट प्रशिक्षण (एचआईपीईडीएस सीडीटी) के लिए उच्च प्रदर्शन एम्बेडेड और वितरित सिस्टम सेंटर को स्वीकार करते हैं। एड्रियन रेपॉक्स वर्तमान में यूके डिमेंशिया रिसर्च इंस्टीट्यूट, केयर रिसर्च एंड टेक्नोलॉजी सेंटर द्वारा वित्त पोषित है। लेखक कृतज्ञतापूर्वक बायोइंजीनियरिंग विभाग में इंपीरियल कॉलेज के जैक बेली को स्वीकार करते हैं, जोव वीडियो लेख के उत्पादन के दौरान प्रयोगों और जानवरों के ऊतकों तक पहुंच में मदद के लिए।
Materials
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
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