Beredning av råtta ischiasnerv för ex vivo neurofysiologi
Summary
Detta protokoll beskriver beredningen av råtta hel ischias nervvävnad för ex vivo elektrofysiologisk stimulering och registrering i ett miljöreglerat, tvåfack, perfuserat saltlösningsbad.
Abstract
Ex vivo-preparat möjliggör studier av många neurofysiologiska processer isolerat från resten av kroppen samtidigt som den lokala vävnadsstrukturen bevaras. Detta arbete beskriver beredningen av råtta ischiasnerver för ex vivo neurofysiologi, inklusive buffertberedning, djurprocedurer, utrustningsinställning och neurofysiologisk registrering. Detta arbete ger en översikt över de olika typer av experiment som är möjliga med denna metod. Den skisserade metoden syftar till att ge 6 timmars stimulering och inspelning på extraherad perifer nervvävnad under tätt kontrollerade förhållanden för optimal konsistens i resultaten. Resultat som erhålls med denna metod är A-fiberföreningsaktionspotentialer (CAP) med topp-till-topp-amplituder i millivoltområdet under hela experimentets varaktighet. CAP-amplituder och former är konsekventa och tillförlitliga, vilket gör dem användbara för att testa och jämföra nya elektroder med befintliga modeller, eller effekterna av ingrepp på vävnaden, såsom användning av kemikalier, kirurgiska förändringar eller neuromodulerande stimuleringstekniker. Både konventionella kommersiellt tillgängliga manschettelektroder med platina-iridiumkontakter och skräddarsydda ledande elastomerelektroder testades och gav liknande resultat när det gäller nervstimulansstyrka-varaktighetssvar.
Introduction
Den nuvarande förståelsen av grundläggande nervfunktion som modellerad i silico saknas i flera aspekter, särskilt med avseende på effekterna av nervvävnadsfack utanför soma, axon och dendriter. Axon-myelininteraktioner är fortfarande dåligt förstådda, vilket framgår av det faktum att även detaljerade beräkningsnervmodeller som MRG1 (för däggdjursnerver) som på ett adekvat sätt fångar konventionellt elektriskt stimuleringssvar, inte fångar andra experimentellt observerade beteenden såsom högfrekvent blocköverföring2 eller sekundärt debutsvar3.
Detta protokoll tillhandahåller en metod för att effektivt undersöka neurofysiologiska processer på nervnivå i en akut liten laboratoriedjurmodell, med hjälp av ett standardiserat beredningsprotokoll för att isolera nerven, kontrollera dess miljö och ta bort den från ett in vivo-sammanhang till ett ex vivo-sammanhang. Detta kommer att förhindra andra kroppsprocesser eller anestetika som används av in vivo nervstimuleringsprotokoll för att ändra nervbeteende och förvirra uppmätta resultat eller deras tolkning 4,5. Detta möjliggör utveckling av mer realistiska modeller som enbart fokuserar på effekter som är specifika för nervvävnader som är dåligt förstådda. Detta protokoll är också användbart som en testbädd för ny nervstimulering och inspelning av elektrodmaterial och geometrier, liksom nya stimuleringsparadigmer som högfrekvent block 2,3. Variationer av denna teknik har tidigare använts för att studera nervfysiologi under tätt kontrollerade förhållanden6, till exempel för att mäta jonkanaldynamik och egenskaper eller effekterna av lokalbedövningsmedel7.
Denna teknik ger flera fördelar jämfört med alternativ som akuta in vivo små djurförsök8. Tekniken undanröjer behovet av att upprätthålla anestesidjupet eftersom vävnaden har extraherats från kroppen, vilket minskar mängden nödvändig utrustning som en bedövningsdiffusor, syrekoncentrator och värmedyna. Detta förenklar det experimentella protokollet, vilket minskar risken för misstag. Eftersom anestetika potentiellt kan förändra nervfunktionen4, säkerställer denna teknik att åtgärder inte kommer att förvirras av biverkningar från dessa bedövningsföreningar. Slutligen är denna teknik mer lämplig än akuta in vivo-experiment när man studerar effekterna av neurotoxiska föreningar såsom tetrodotoxin, vilket skulle döda ett sövt djur genom förlamning.
Perifera nervsektioner är ett unikt ex vivo-system eftersom det finns en stor chans att fibrerna som är ansvariga för inspelade neurala signaler inte innehåller någon soma. Eftersom dessa normalt skulle vara belägna, för motorneuroner, i ryggraden och för sensoriska neuroner i dorsala rotganglierna bredvid ryggraden, kan beredningen av en del av däggdjursnerven grovt modelleras som en samling rörformiga membran med jonkanaler, öppna i båda ändarna9. Metabolism upprätthålls av mitokondrierna som ligger i axonen vid tidpunkten för vävnadsdissektion10. Suturering av de öppna ändarna av axolemmen uppmuntras efter extraktion för att stänga dem och därigenom hjälpa till att upprätthålla befintliga joniska gradienter över membranet, vilket är viktigt för normal nervfunktion.
För att upprätthålla vävnadshomeostas utanför kroppen måste flera miljövariabler kontrolleras tätt. Dessa är temperatur11, syresättning12, osmolaritet, pH13,14 och tillgång till glukos för att upprätthålla ämnesomsättningen. För detta protokoll är tillvägagångssättet att använda en modifierad Krebs-Henseleit-buffert 15,16 (mKHB) kontinuerligt luftad med en blandning av syre och koldioxid. mKHB är i familjen kardioplegiska buffertar 6,17 som används för att bevara dissekerade vävnader utanför kroppen, till exempel i ex vivo-experiment. Dessa buffertar innehåller inget hemoglobin, antibiotika eller antifungaler och är därför endast lämpliga för preparat som involverar små mängder vävnad under en begränsad tid. pH-kontroll uppnåddes med karbonat- och koldioxid redoxparet, vilket krävde konstant luftning av bufferten med koldioxid för att upprätthålla pH-jämvikt. Detta för att undvika att använda andra vanliga buffringsmedel som HEPES, som kan modifiera nervcellsfunktion18. För att syresätta bufferten och ge pH-kontroll användes en blandning av 5% koldioxid i syre som kallas karbogen (95% O2, 5%CO2). En värmeomrörare användes för temperaturkontroll av en buffertbehållare, och bufferten perfuserades genom ett nervbad och återcirkulerades sedan till startbehållaren. Ett typiskt experiment skulle pågå i 6-8 timmar innan nerven förlorar sin livskraft och inte längre svarar tillräckligt på stimulering för att åtgärder ska vara representativa för frisk vävnad.
För att optimera signal-brusförhållandet användes silverkloridelektroder för inspelning, vilka framställdes enligt tidigare beskrivna metoder19. För stimulering kan en kombination av kommersiella platinamanschettelektroder och skräddarsydda ledande polymermanschettelektroder användas. Ledande polymermanschettelektroder har särskilt högre laddningskapacitet, vilket är användbart när man stimulerar nerven med hjälp av vågformer med hög amplitud20.
Stimulatorn som används i detta protokoll har tidigare beskrivits20. Dokumentation, designfiler och programvaruskript för att använda den är offentligt tillgängliga21. Andra stimulatorer kan användas för att utföra detta protokoll; emellertid är den anpassade stimulatorn också kapabel till högfrekvent alternativström (HFAC) block 2,20, vilket möjliggör ett bredare spektrum av neurofysiologiska experiment. För att använda HFAC-block rekommenderas ledande elastomermanschetter för att undvika skador på nerven. Ledande elastomernervmanschetter är mjuka och helt polymera elektrodmatriser framställda av ledande elastomerer som ledande komponent och polydimetylsiloxan som isolering22. Enheterna tillverkades i en bipolär konfiguration med hjälp av konventionella lasermikrofabrikationstekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta arbete beskrev vi ett protokoll för att förbereda råtta ischiasnerver för ex vivo neurofysiologi. Vävnadsextraktion tar cirka 30 minuter, inklusive djurhantering, anestesi, avlivning och dissektion, medan nervrengöring, placering i badet och elektrodimplantation bör kräva ytterligare 30 minuter innan inspelningen kan startas. Buffertberedning kan utföras på 30 minuter, men detta kan göras före resten av experimentet. Denna typ av preparat och experiment har använts och beskrivits under de se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Dr. Gerald Hunsberger från GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, USA och Galvani Bioelectronics (Stevenage, Storbritannien) för att ha delat sin ursprungliga nervberedningsteknik med oss. Författarna erkänner Robert Toth för Dual-Chamber nervbaddesign. Författarna erkänner finansiering från Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) -bidraget från Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). Författarna erkänner High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) vid Imperial College London för finansiering av Adrien Rapeaux (EP/L016796/1). Adrien Rapeaux finansieras för närvarande av UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Författarna erkänner tacksamt Zack Bailey från Imperial College, vid Institutionen för bioteknik, för hjälp med experiment och tillgång till djurvävnader under produktionen av JoVE-videoartikeln.
Materials
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. Acid-base homeostasis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021)
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
