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Biologie

Ein integrierter Ansatz zur Identifizierung und Sequenzanalyse von Mikroproteinen

Published: July 12, 2022
doi:
10.3791/63841
, ,
1The Heart Institute, Division of Molecular Cardiovascular Biology,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics,University of Cincinnati College of Medicine

Summary

Das hier beschriebene Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Analyse genomischer Regionen von Interesse auf Mikroprotein-kodierendes Potenzial mit PhyloCSF im benutzerfreundlichen UCSC Genome Browser. Darüber hinaus werden mehrere Werkzeuge und Ressourcen empfohlen, um die Sequenzeigenschaften identifizierter Mikroproteine weiter zu untersuchen und Einblicke in ihre mutmaßlichen Funktionen zu erhalten.

Abstract

Next-Generation-Sequencing (NGS) hat das Gebiet der Genomik vorangetrieben und ganze Genomsequenzen für zahlreiche Tierarten und Modellorganismen hervorgebracht. Trotz dieser Fülle an Sequenzinformationen haben sich umfassende Genannotationsbemühungen als schwierig erwiesen, insbesondere für kleine Proteine. Insbesondere wurden konventionelle Proteinannotationsmethoden entwickelt, um mutmaßliche Proteine absichtlich auszuschließen, die durch kurze offene Leserahmen (sORFs) mit einer Länge von weniger als 300 Nukleotiden kodiert werden, um die exponentiell höhere Anzahl falscher nichtkodierender sORFs im gesamten Genom herauszufiltern. Infolgedessen wurden Hunderte von funktionellen kleinen Proteinen, die Mikroproteine genannt werden (<100 Aminosäuren lang), fälschlicherweise als nicht-kodierende RNAs klassifiziert oder ganz übersehen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um kostenlose, öffentlich verfügbare bioinformatische Werkzeuge zu nutzen, um genomische Regionen nach Mikroprotein-kodierendem Potenzial auf der Grundlage evolutionärer Konservierung abzufragen. Insbesondere bieten wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Untersuchung der Sequenzerhaltung und des Kodierungspotenzials mit phylogenetischen Codon-Substitutionsfrequenzen (PhyloCSF) im benutzerfreundlichen Genome Browser der University of California Santa Cruz (UCSC). Darüber hinaus beschreiben wir Schritte zur effizienten Generierung mehrerer Speziesausrichtungen identifizierter Mikroproteinsequenzen, um die Erhaltung der Aminosäuresequenz zu visualisieren, und empfehlen Ressourcen zur Analyse von Mikroproteineigenschaften, einschließlich vorhergesagter Domänenstrukturen. Diese leistungsstarken Werkzeuge können verwendet werden, um mutmaßliche Mikroprotein-kodierende Sequenzen in nicht-kanonischen genomischen Regionen zu identifizieren oder das Vorhandensein einer konservierten kodierenden Sequenz mit translationalem Potenzial in einem nicht-kodierenden Transkript von Interesse auszuschließen.

Introduction

Die Identifizierung des gesamten Satzes kodierender Elemente im Genom ist seit Beginn des Humangenomprojekts ein wichtiges Ziel und bleibt ein zentrales Ziel für das Verständnis biologischer Systeme und die Ätiologie genetisch bedingter Krankheiten 1,2,3,4. Fortschritte in der NGS-Technik haben zur Produktion ganzer Genomsequenzen für eine große Anzahl von Organismen geführt, darunter Wirbeltiere, Wirbellose, Hefen und Pflanzen5. Darüber hinaus haben transkriptionelle Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden die Komplexität des zellulären Transkriptoms weiter aufgedeckt und Tausende neuartiger RNA-Moleküle mit proteinkodierenden und nicht-kodierenden Funktionen identifiziert 6,7. Die Entschlüsselung dieser riesigen Menge an Sequenzinformationen ist ein fortlaufender Prozess, und die Herausforderungen bei umfassenden Genannotationsbemühungenbleiben bestehen 8.

Die jüngste Entwicklung translationaler Profilierungsmethoden, einschließlich Ribosomenprofilierung 9,10 und Polyribosomensequenzierung 11, hat Hinweise darauf geliefert, dass Hunderte von nichtkanonischen Translationsereignissen derzeit unannotierten sORFs im gesamten Genom zugeordnet sind, mit dem Potenzial, kleine Proteine zu erzeugen, die Mikroproteine oder Mikropeptide genannt werden 12,13,14,15,16, 17. Mikroproteine haben sich aufgrund ihrer geringen Größe (<100 Aminosäuren) und des Fehlens klassischer proteinkodierender Geneigenschaften 8,12,18,19,20 bisher von Standard-Genannotationsmethoden übersehen. Mikroproteine wurden in praktisch allen Organismen beschrieben, einschließlich Hefe 21,22, Fliegen 17,23,24 und Säugetieren 25,26,27,28, und es wurde gezeigt, dass sie eine entscheidende Rolle in verschiedenen Prozessen spielen, einschließlich Entwicklung, Stoffwechsel und Stresssignalisierung 19,20,29, 30,31,32,33,34. Daher ist es unerlässlich, das Genom weiterhin nach zusätzlichen Mitgliedern dieser lange übersehenen Klasse funktioneller kleiner Proteine zu durchsuchen.

Trotz der weit verbreiteten Anerkennung der biologischen Bedeutung von Mikroproteinen ist diese Klasse von Genen in Genomannotationen nach wie vor stark unterrepräsentiert, und ihre genaue Identifizierung ist nach wie vor eine ständige Herausforderung, die den Fortschritt auf diesem Gebiet behindert hat. Verschiedene Berechnungswerkzeuge und experimentelle Methoden wurden kürzlich entwickelt, um die Schwierigkeiten zu überwinden, die mit der Identifizierung von Mikroprotein-kodierenden Sequenzen verbunden sind (ausführlich diskutiert in mehreren umfassenden Übersichtsarbeiten 8,35,36,37). Viele neuere Mikroprotein-Identifizierungsstudien 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 haben sich stark auf die Verwendung eines solchen Algorithmus namens PhyloCSF verlassen 48,49 , ein leistungsstarker vergleichender Genomikansatz, der genutzt werden kann, um konservierte proteinkodierende Regionen des Genoms von denen zu unterscheiden, die nicht kodierend sind.

PhyloCSF vergleicht Codon-Substitutionshäufigkeiten (CSF) unter Verwendung von Multispezies-Nukleotid-Alignments und phylogenetischen Modellen, um evolutionäre Signaturen von proteinkodierenden Genen nachzuweisen. Dieser empirische modellbasierte Ansatz beruht auf der Prämisse, dass Proteine in erster Linie auf der Aminosäureebene und nicht auf der Nukleotidsequenz konserviert werden. Daher werden synonyme Codon-Substitutionen, die die gleiche Aminosäure kodieren, oder Codon-Substitutionen zu Aminosäuren mit konservierten Eigenschaften (dh Ladung, Hydrophobie, Polarität) positiv bewertet, während nicht-synonyme Substitutionen, einschließlich Missverständnisse und Unsinnssubstitutionen, negativ abschneiden. PhyloCSF wird auf Daten des gesamten Genoms trainiert und hat sich als wirksam erwiesen, um kurze Teile einer kodierenden Sequenz (CDS) isoliert von der vollständigen Sequenz zu bewerten, was bei der Analyse von Mikroproteinen oder einzelnen Exons von Standardprotein-kodierenden Genenerforderlich ist 48,49.

Insbesondere die jüngste Integration der PhyloCSF-Track-Hubs in den Genome Browser 49,50,51 der University of California Santa Cruz (UCSC) ermöglicht es Ermittlern aller Hintergründe, leicht auf eine benutzerfreundliche Oberfläche zuzugreifen, um genomische Regionen von Interesse nach Proteinkodierungspotenzial abzufragen. Das unten beschriebene Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zum Laden der PhyloCSF-Track-Hubs im UCSC Genome Browser und zur anschließenden Abfrage genomischer Regionen, die für die Suche nach proteinkodierenden Regionen mit hohem Konfidenzniveau (oder deren Fehlen) von Interesse sind. Darüber hinaus werden in dem Fall, in dem ein positiver PhyloCSF-Score beobachtet wird, Schritte beschrieben, um das mikroproteinkodierende Potenzial weiter zu analysieren und effizient mehrere Speziesausrichtungen der identifizierten Aminosäuresequenzen zu generieren, um die Sequenzerhaltung zwischen den Spezies zu veranschaulichen. Schließlich werden in der Diskussion mehrere zusätzliche öffentlich zugängliche Ressourcen und Werkzeuge vorgestellt, um identifizierte Mikroproteineigenschaften zu untersuchen, einschließlich vorhergesagter Domänenstrukturen und Einblicke in die mutmaßliche Mikroproteinfunktion.

Protocol

Das unten beschriebene Protokoll beschreibt die Schritte zum Laden und Navigieren in den PhyloCSF-Browserspuren im UCSC Genome Browser (generiert von Mudge et al.49). Für allgemeine Fragen zum UCSC Genome Browser finden Sie hier ein umfangreiches Genome Browser User’s Guide: https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html. 1. Laden des PhyloCSF Track Hubs in den UCSC Genome Browser<…

Representative Results

Hier zeigen wir am Beispiel des validierten Mikroproteins Mitoregulin (Mtln), wie ein konservierter sORF einen positiven PhyloCSF-Score generiert, der im UCSC Genome Browser leicht visualisiert und analysiert werden kann. Mitoregulin wurde zuvor als nicht-kodierende RNA annotiert (früher humane Gen-ID LINC00116 und Maus-Gen-ID 1500011K16Rik). Vergleichende Methoden der Genomik und der Sequenzerhaltungsanalyse spielten eine entscheidende Rolle bei der ersten Entdeckung 40,57,58,59,60,61<sup class="xref…

Discussion

Das hier vorgestellte Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Abfrage genomischer Regionen von Interesse für Mikroprotein-kodierendes Potenzial mit PhyloCSF auf dem benutzerfreundlichen UCSC Genome Browser 48,49,50,51. Wie oben beschrieben, ist PhyloCSF ein leistungsstarker vergleichender Genomik-Algorithmus, der phylogenetische Modelle und Codon-Substitutionsfrequenzen inte…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (HL-141630 und HL-160569) und der Cincinnati Children’s Research Foundation (Trustee Award) unterstützt.

Materials

Website Website Address Requirements
Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Tool https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ Web browser Multiple sequence alignment program for the efficient alignment of FASTA sequences (i.e. for cross-species comparison of identified microproteins)
COXPRESSdb https://coxpresdb.jp Web browser Provides co-regulated gene relationships to estimate gene functions
EMBL-EBI Bioinformatics Tools FAQs https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ Web browser Frequently Asked Questions (FAQs) for EMBL-EBI tools. Includes the color coding key for protein sequence alignments
European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI),
Tools and Data Resources		 https://www.ebi.ac.uk/services/all Web browser Comprehensive list of freely available websites, tools and data resources
Expasy – Swiss Bioinformatics Resource Portal https://www.expasy.org Web browser Suite of bioinformatic tools and resources for protein sequence analysis that is maintained by the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)
National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Conserved Domain Search		 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi Web browser Search tool to identify conserved domains within protein or coding nucleotide sequences
Pfam 35 http://pfam.xfam.org Web browser Protein family (Pfam) database, provides alignments and classification of protein families and domains
PhyloCSF Track Hub Description https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q
edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10
&c=chr2&g=hub_109801_
PhyloCSF_smooth		 Web browser Detailed description of the Smoothed PhyloCSF tracks and PhyloCSF Track Hub
   
   
   
   
   
SignalP 6.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0 Web browser Predicts the presence of signal peptides and the location of their cleavage sites
TMHMM – 2.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0 Web browser Prediction of transmembrane helices in proteins
UCSC Genome Browser BLAT Search https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat Web browser Tool used to find genomic regions using DNA or protein sequence information
UCSC Genome Browser Gateway https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway Web browser Direct link to the UCSC Genome Browser Gateway
UCSC Genome Browser Home https://genome.ucsc.edu/ Web browser Home website for the UCSC Genome Browser
UCSC Genome Browser Track Data Hubs https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs Web browser Direct link to Track Data Hubs/Public Hubs database to search for and load the PhyloCSF Tracks
UCSC Genome Browser User Guide https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html Web browser Comprehensive user guide detailing how to navigate the UCSC Genome Browser
WoLF PSORT https://wolfpsort.hgc.jp Web browser Protein subcellular localization prediction tool
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Brito-Estrada, O., Hassel, K. R., Makarewich, C. A. An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis. J. Vis. Exp. (185), e63841, doi:10.3791/63841 (2022).
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