Myg-associeret virusisolering fra feltindsamlede myg
Summary
Talrige nye viruslignende sekvenser er fundet i myg på grund af den omfattende brug af sekventeringsteknologier. Vi leverer en effektiv procedure til isolering og forstærkning af vira ved hjælp af hvirveldyr og mygcellelinjer, som kan tjene som grundlag for fremtidige undersøgelser af myggeassocierede vira, herunder myggebårne og myggespecifikke vira.
Abstract
Med den brede anvendelse af sekventeringsteknologier er mange nye viruslignende sekvenser blevet opdaget i leddyr, herunder myg. De to hovedkategorier af disse nye myggeassocierede vira er “myggebårne vira (MBV’er)” og “myggespecifikke vira (MSV’er)”. Disse nye vira kan være patogene for både hvirveldyr og myg, eller de kan bare være symbiotiske med myg. Entitetsvira er afgørende for at bekræfte disse viras biologiske egenskaber. Således er der beskrevet en detaljeret protokol her for virusisolering og forstærkning fra feltindsamlede myg. Først blev myggeprøverne fremstillet som supernatanter af myggehomogenater. Efter centrifugering to gange blev supernatanterne podet til enten mygcellelinje C6/36 eller hvirvelcellelinje BHK-21 til virusamplifikation. Efter 7 dage blev supernatanterne opsamlet som P1-supernatanter og opbevaret ved -80 °C. Dernæst blev P1-supernatanter passeret to gange mere i C6/36- eller BHK-21-celler, mens cellestatus blev kontrolleret dagligt. Når cytopatogen virkning (CPE) på cellerne blev opdaget, blev disse supernatanter indsamlet og anvendt til at identificere vira. Denne protokol tjener som grundlag for fremtidig forskning i myg-associerede vira, herunder MBV’er og MSV’er.
Introduction
Myg er en gruppe af vigtige patogene leddyrvektorer. Der er cirka 3.500 arter af myg i familien Culicidae 1,2. Udviklingen af high-throughput sekventeringsteknologier har ført til opdagelsen af mange nye, viruslignende sekvenser i myg fra forskellige dele af verden3. Generelt kan disse myg-associerede vira klassificeres i to hovedgrupper: MBV’er og MSV’er.
MBV’er er en gruppe af forskellige vira, der er årsagsmidler til mange sygdomme hos mennesker eller dyr, såsom gul feber-virus (YFV), dengue-virus (DENV), japansk encefalitisvirus (JEV), West Nile-virus (WNV) og Rift Valley fever-virus (RVFV)4. De har alvorligt truet folkesundheden ved at forårsage alvorlig sygelighed og dødelighed hos både mennesker og dyr over hele verden. MBV’er opretholder naturligt en livscyklus mellem forskellige værter gennem transmission fra en inficeret myg til en naiv vært såvel som fra en virusinficeret vært og til en fodringsmyg5. Derfor kan disse vira inficere både mygcellelinjer og hvirveldyrcellelinjer i laboratoriet1.
MSV’er, som omfatter Yichang-virus (YCN), Culex flavivirus (CxFV) og Chaoyang-virus (CHAOV), er en undergruppe af insektspecifikke vira 1,6,7. I de senere år har der været en stigning i opdagelsen af nye MSV’er, og nogle af disse MSV’er har vist sig at have en indvirkning på transmissionen af MBV’er. For eksempel kan CxFV, som kan være en vedvarende infektion i Culex pipiens, undertrykke WNV-replikation på et tidligt stadium8. Et andet insektspecifikt flavivirus, cellefusionsmiddelvirus (CFAV), har vist sig at hæmme udbredelsen af DENV og Zika-virus (ZIKV) i Aedes aegypti-myg 9. Således er denne protokol en nyttig tilgang til isolering af mygassocierede vira og kan hjælpe med yderligere forskning i fordelingen af patogener relateret til myg og kontrol af mygbårne sygdomme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med denne metode var at tilbyde en praktisk måde at isolere myg-associerede vira ved hjælp af forskellige cellelinjer. Det er afgørende at tilsætte antibiotika-antimykotikum (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin) til myggehomogenaternes supernatanter for at undgå forurening med bakterier eller svampe. Myg og evirale supernatanter i marken skal nedkøles ved -80 °C for at undgå gentagne cyklusser med fryse-optøning.
Et andet kritisk trin i protokollen var slibning. Mygprøver …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873 (2019).
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. . Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
