Muggen-geassocieerde virusisolatie van in het veld verzamelde muggen
Summary
Talrijke nieuwe virusachtige sequenties zijn gevonden in muggen als gevolg van het uitgebreide gebruik van sequencing-technologieën. We bieden een effectieve procedure voor het isoleren en versterken van virussen met behulp van gewervelde en muggencellijnen, die als basis kunnen dienen voor toekomstige studies naar muggengerelateerde virussen, waaronder door muggen overgedragen en muggenspecifieke virussen.
Abstract
Met de brede toepassing van sequencingtechnologieën zijn veel nieuwe virusachtige sequenties ontdekt in geleedpotigen, waaronder muggen. De twee belangrijkste categorieën van deze nieuwe muggen-geassocieerde virussen zijn “mug-borne virussen (MBV’s)” en “mug-specifieke virussen (MSV’s)”. Deze nieuwe virussen kunnen pathogeen zijn voor zowel gewervelde dieren als muggen, of ze kunnen gewoon symbiotisch zijn met muggen. Entiteitsvirussen zijn essentieel om de biologische kenmerken van deze virussen te bevestigen. Zo is hier een gedetailleerd protocol beschreven voor virusisolatie en versterking van in het veld verzamelde muggen. Eerst werden de muggenmonsters bereid als supernatanten van muggenhomogenaten. Na tweemaal centrifugeren werden de supernatanten vervolgens ingeënt in muggencellijn C6/36 of gewervelde cellijn BHK-21 voor virusversterking. Na 7 dagen werden de supernatanten verzameld als de P1-supernatanten en bewaard bij -80 °C. Vervolgens werden P1-supernatanten nog twee keer gepasseerd in C6/36- of BHK-21-cellen terwijl de celstatus dagelijks werd gecontroleerd. Toen cytopathogeen effect (CPE) op de cellen werd ontdekt, werden deze supernatanten verzameld en gebruikt om virussen te identificeren. Dit protocol dient als basis voor toekomstig onderzoek naar muggen-geassocieerde virussen, waaronder MBV’s en MSV’s.
Introduction
Muggen zijn een groep belangrijke pathogene geleedpotige vectoren. Er zijn ongeveer 3.500 soorten muggen in de familie Culicidae 1,2. De ontwikkeling van high-throughput sequencing-technologieën heeft geleid tot de ontdekking van vele nieuwe, virusachtige sequenties in muggen uit verschillende delen van de wereld3. Over het algemeen kunnen deze muggengerelateerde virussen worden ingedeeld in twee hoofdgroepen: MBV’s en MSV’s.
MBV’s zijn een groep van diverse virussen die veroorzakers zijn van veel menselijke of dierlijke ziekten, zoals gelekoortsvirus (YFV), denguevirus (DENV), Japans encefalitisvirus (JEV), Westnijlvirus (WNV) en Rift Valley-koortsvirus (RVFV)4. Ze hebben de volksgezondheid ernstig bedreigd door ernstige morbiditeit en mortaliteit te veroorzaken bij zowel mensen als dieren over de hele wereld. MBV’s ondersteunen van nature een levenscyclus tussen verschillende gastheren door overdracht van een geïnfecteerde mug naar een naïeve gastheer, evenals van een met virus geïnfecteerde gastheer en naar een voedende mug5. Daarom kunnen deze virussen zowel muggencellijnen als gewervelde cellijnen in het labinfecteren 1.
MSV’s, waaronder Yichang-virus (YCN), Culex flavivirus (CxFV) en Chaoyang-virus (CHAOV), zijn een subgroep van insectenspecifieke virussen 1,6,7. In de afgelopen jaren is er een toename geweest in de ontdekking van nieuwe MSV’s, en sommige van deze MSV’s blijken een impact te hebben op de transmissie van MBV’s. CxFV, dat een aanhoudende infectie in Culex pipiens kan zijn, kan bijvoorbeeld WNV-replicatie in een vroeg stadiumonderdrukken 8. Een ander insectspecifiek flavivirus, cell-fusing agent virus (CFAV), blijkt de verspreiding van DENV- en Zika-virus (ZIKV) in Aedes aegypti-muggen te remmen 9. Dit protocol is dus een nuttige benadering voor het isoleren van muggen-geassocieerde virussen en kan helpen bij verder onderzoek naar de verspreiding van pathogenen gerelateerd aan muggen en de bestrijding van door muggen overgedragen ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van deze methode was om een praktische manier te bieden voor het isoleren van muggen-geassocieerde virussen met behulp van verschillende cellijnen. Het is van cruciaal belang om het antibioticum-antimycoticum (penicilline-streptomycine-amfotericine) toe te voegen aan de supernatanten van de muggenhomogenaten om besmetting door bacteriën of schimmels te voorkomen. Muggen en virale supernatanten die in het veld worden verkregen, moeten bij -80 °C worden gekoeld om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen.
<p c…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873 (2019).
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. . Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
