野外採集蚊からの蚊関連ウイルスの分離
Summary
シーケンシング技術の広範な使用により、蚊には多数の新しいウイルス様配列が見出されている。脊椎動物や蚊の細胞株を用いてウイルスを単離・増幅するための効果的な手順を提供し、蚊媒介性ウイルスや蚊特異的ウイルスを含む蚊関連ウイルスの将来の研究の基礎となる可能性があります。
Abstract
シーケンシング技術の幅広い応用により、蚊を含む節足動物において多くの新しいウイルス様配列が発見されている。これらの新しい蚊関連ウイルスの2つの主要なカテゴリは、「蚊媒介性ウイルス(MBV)」と「蚊特異的ウイルス(MSV)」です。これらの新しいウイルスは、脊椎動物と蚊の両方に病原性があるか、単に蚊と共生している可能性があります。エンティティウイルスは、これらのウイルスの生物学的特性を確認するために不可欠です。したがって、野外で収集された蚊からのウイルスの単離および増幅のための詳細なプロトコルがここに記載されている。まず、蚊試料を蚊ホモジネートの上清として調製した。2回遠心分離した後、上清をウイルス増幅のために蚊細胞株C6/36または脊椎動物細胞株BHK-21のいずれかに接種した。7日後、上清をP1上清として回収し、-80°Cで保存した。 次に、P1上清をC6/36またはBHK-21細胞にさらに2回継代し、細胞の状態を毎日チェックしました。細胞に対する細胞病原性効果(CPE)が発見されたとき、これらの上清を回収し、ウイルスを同定するために使用しました。このプロトコルは、MBVやMSVを含む蚊関連ウイルスに関する将来の研究の基礎として機能します。
Introduction
蚊は重要な病原性節足動物ベクターのグループです。Culicidae 1,2科には約3,500種の蚊がいます。ハイスループットシーケンシング技術の開発により、世界各地の蚊で多くの新しいウイルス様配列が発見されました3。一般に、これらの蚊関連ウイルスは、MBVとMSVの2つの主要なグループに分類できます。
MBVは、黄熱病ウイルス(YFV)、デング熱ウイルス(DENV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、リフトバレー熱ウイルス(RVFV)など、多くのヒトまたは動物の病気の原因となる多様なウイルスのグループです4。彼らは、世界中の人間と動物の両方に深刻な罹患率と死亡率を引き起こすことにより、公衆衛生を深刻に脅かしてきました。MBVは、感染した蚊からナイーブな宿主、およびウイルスに感染した宿主から摂食蚊への感染を通じて、多様な宿主間のライフサイクルを自然に維持します5。したがって、これらのウイルスは、実験室1で蚊細胞株と脊椎動物細胞株の両方に感染する可能性があります。
宜昌ウイルス(YCN)、アカイエカフラビウイルス(CxFV)、および朝陽ウイルス(CHAOV)を含むMSVは、昆虫特異的ウイルスのサブグループです1,6,7。近年、新規MSVの発見が増加しており、これらのMSVのいくつかはMBVの伝送に影響を与えることがわかっています。たとえば、アカイエカの持続感染である可能性があるCxFVは、WNV複製を早期に抑制する可能性があります8。別の昆虫特異的フラビウイルスである細胞融合剤ウイルス(CFAV)は、ネッタイシマカにおけるDENVおよびジカウイルス(ZIKV)の増殖を阻害することがわかっています9。したがって、このプロトコルは、蚊関連ウイルスを分離するための有用なアプローチであり、蚊に関連する病原体の分布および蚊媒介性疾患の制御に関するさらなる研究に役立つ可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法の目的は、さまざまな細胞株を使用して蚊関連ウイルスを分離するための実用的な方法を提供することでした。細菌や真菌による汚染を避けるために、抗生物質-抗真菌剤(ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシン)を蚊のホモジネートの上清に加えることが重要です。.現場で得られた蚊やウイルス上清は、凍結融解サイクルの繰り返しを避けるために、-80°Cで冷蔵する必要が?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、武漢科学技術計画プロジェクト(2018201261638501)によってサポートされました。
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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