Ex Vivo Modello organoide delle delezioni geniche mediate da Adenovirus-Cre in cellule uroteliali di topo
Summary
Questo protocollo descrive il processo di generazione e caratterizzazione di organoidi uroteliali di topo che ospitano delezioni in geni di interesse. I metodi includono la raccolta di cellule uroteliali di topo, la trasduzione ex vivo con adenovirus che guida l’espressione di Cre con un promotore CMV e la caratterizzazione in vitro e in vivo .
Abstract
Il cancro della vescica è un’area poco studiata, in particolare nei modelli murini geneticamente modificati (GEMM). I GEMM inbred con siti Cre e loxP specifici per i tessuti sono stati i gold standard per il targeting genico condizionale o inducibile. Per fornire modelli sperimentali più rapidi ed efficienti, viene sviluppato un sistema di coltura organoide ex vivo utilizzando adenovirus Cre e cellule uroteliali normali che trasportano più alleli loxP dei soppressori tumorali Trp53, Pten e Rb1. Le cellule uroteliali normali sono enzimaticamente dissociate da quattro vesciche di topi a triplo flosso (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). Le cellule uroteliali sono trasdotte ex vivo con adenovirus-Cre guidato da un promotore CMV (Ad5CMVCre). Gli organoidi vescicali trasdotti vengono coltivati, propagati e caratterizzati in vitro e in vivo. La PCR viene utilizzata per confermare le delezioni geniche in Trp53, Pten e Rb1. La colorazione a immunofluorescenza (IF) degli organoidi dimostra un’espressione positiva dei marcatori di lignaggio uroteliale (CK5 e p63). Gli organoidi vengono iniettati per via sottocutanea nei topi ospiti per l’espansione del tumore e i passaggi seriali. L’immunoistochimica (IHC) degli xenotrapianti mostra un’espressione positiva di CK7, CK5 e p63 e un’espressione negativa di CK8 e Uroplakin 3. In sintesi, la delezione genica mediata da adenovirus da cellule uroteliali di topo ingegnerizzate con siti loxP è un metodo efficace per testare rapidamente il potenziale tumorigenico di alterazioni genetiche definite.
Introduction
Il cancro della vescica è il quarto tumore più comune negli uomini e colpisce più di 80.000 persone ogni anno negli Stati Uniti1. La chemioterapia a base di platino è stata lo standard di cura per i pazienti con carcinoma della vescica avanzato per più di tre decenni. Il panorama del trattamento del cancro alla vescica è stato rivoluzionato dalla recente approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) dell’immunoterapia (inibitori del checkpoint immunitario anti-PD-1 e anti-PD-L1), erdafitinib (un inibitore del recettore del fattore di crescita dei fibroblasti) e enfortumab vedotin (un coniugato anticorpo-farmaco)2,3,4. Tuttavia, non sono disponibili biomarcatori clinicamente approvati per prevedere le risposte alla chemioterapia o all’immunoterapia. C’è un bisogno critico di generare modelli preclinici informativi che possano migliorare la comprensione dei meccanismi che guidano la progressione del cancro alla vescica e sviluppare biomarcatori predittivi per diverse modalità di trattamento.
Uno dei principali ostacoli nella ricerca traslazionale della vescica è la mancanza di modelli preclinici che ricapitolano la patogenesi del cancro della vescica umana e le risposte al trattamento 5,6. Sono stati sviluppati più modelli preclinici, tra cui modelli 2D in vitro (linee cellulari o cellule riprogrammate condizionatamente), modelli 3D in vitro (organoidi, stampa 3D) e modelli in vivo (xenotrapianto, modelli indotti da agenti cancerogeni, geneticamente modificati e xenotrapianti derivati dal paziente)2,6. I modelli murini geneticamente modificati (GEMM) sono utili per molte applicazioni nella biologia del cancro della vescica, tra cui analisi dei fenotipi tumorali, indagini meccanicistiche di geni candidati e /o vie di segnalazione e la valutazione preclinica delle risposte terapeutiche 6,7. I GEMM possono utilizzare ricombinasi sito-specifiche (Cre-loxP) per controllare le delezioni genetiche in uno o più geni oncosoppressori. Il processo di generazione dei GEMM desiderati con delezioni geniche multiple è dispendioso in termini di tempo, laborioso e costoso5. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di sviluppare un metodo rapido ed efficiente di consegna cre ex vivo per stabilire modelli di triplo knockout (TKO) della vescica da cellule uroteliali di topo normali portatrici di alleli a triplo flosso (Trp53, Pten e Rb1)8. Il principale vantaggio del metodo ex vivo è il flusso di lavoro veloce (1-2 settimane invece di anni di allevamento di topi). Questo articolo descrive il protocollo per la raccolta di cellule uroteliali normali con alleli floxed, trasduzione di adenovirus ex vivo, colture organoidi e caratterizzazione in vitro e in vivo in topi immunocompetenti C57 BL/6J. Questo metodo può essere ulteriormente utilizzato per generare organoidi clinicamente rilevanti per il cancro della vescica in topi immunocompetenti che ospitano qualsiasi combinazione di alleli floxed.
Protocol
Representative Results
Discussion
I GEMM sono stati i gold standard per la modellazione del cancro avviata da cellule normali, consentendo di testare rigorosamente le conseguenze di potenziali perturbazioni oncogeniche (attivazione di oncogeni e / o perdita di soppressori tumorali). Qui, viene fornito un protocollo rapido ed efficiente per generare organoidi del cancro della vescica tramite editing genetico ex vivo di normali cellule uroteliali di topo che trasportano alleli flosci in geni di interesse. La colorazione H&E e IHC dimostra che gli …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro di ricerca è stato supportato in parte da NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 e R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation e Friends of Urology Foundation. Ringraziamo Marisa Blask e Mila Pakhomova per aver revisionato il manoscritto.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
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