Биоанализ клеток Caco-2 для измерения биодоступности пищевого железа
Summary
Биоанализ клеток Caco-2 на биодоступность железа (Fe) представляет собой экономически эффективный и универсальный подход к оценке биодоступности Fe из продуктов питания, пищевых продуктов, добавок, блюд и даже режимов диеты. Тщательно подтвержденный для исследований на людях, он представляет собой современное состояние для исследований биодоступности Fe.
Abstract
Знание биодоступности Fe имеет решающее значение для оценки питательных качеств Fe в пищевых продуктах. Измерение биодоступности Fe in vivo ограничено стоимостью, пропускной способностью и предостережениями, присущими изотопной маркировке пищевого Fe. Таким образом, существует острая необходимость в подходе, который был бы высокопроизводительным и экономически эффективным. Биоанализ клеток Caco-2 был разработан для удовлетворения этой потребности. Биоанализ клеток Caco-2 для биодоступности Fe использует смоделированное желудочное и кишечное пищеварение в сочетании с культурой кишечной эпителиальной клеточной линии человека, известной как Caco-2. В клетках Caco-2 поглощение Fe стимулирует внутриклеточное образование ферритина, белка хранения Fe, легко измеряемого с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Ферритин образуется пропорционально поглощению Fe; Таким образом, измеряя выработку ферритина клеток Caco-2, можно оценить поглощение кишечного Fe из смоделированных пищевых перевариваний в энтероцит.
Благодаря этому подходу модель воспроизводит ключевой начальный шаг, который определяет биодоступность пищевых продуктов Fe. С момента своего создания в 1998 году этот модельный подход тщательно сравнивался с факторами, которые, как известно, влияют на биодоступность Fe человека. Кроме того, он был применен в параллельных исследованиях, с тремя исследованиями эффективности человека, оценивающими биообогащенные культуры Fe. Во всех случаях биоанализ правильно предсказал относительные количества биодоступности Fe от факторов, культур и общего рациона. В данной статье представлены подробные методы изучения клеточной культуры Caco-2 в сочетании с процессом переваривания in vitro и ИФА клеточного ферритина, необходимыми для проведения биоанализа клеток Caco-2 на биодоступность Fe.
Introduction
Чтобы полностью понять исследовательскую потребность и преимущества биоанализа клеток Caco-2 для биодоступности Fe, необходимо сначала понять подходы, которые существовали до появления этой модели. Измерение биодоступности Fe из пищи или пищи in vivo является сложной задачей, особенно когда комбинации продуктов питания должны быть оценены в еде или диете. Изотопная маркировка была наиболее распространенным подходом к измерению биодоступности Fe за последние 50 лет1. Изотопная маркировка используется для одноразовых и многоразовых исследований и непрактична для долгосрочных исследований. Стабильные изотопы Fe, такие как 57Fe и 58Fe, являются наиболее часто используемыми; тем не менее, исследования были проведены с радиоизотопами, такими как 59Fe, с использованием подсчета всего тела2. Для растительных продуктов изотопная маркировка была выполнена с помощью внешней или внутренней маркировки. Для внешней маркировки известное количество изотопа добавляют в пищу или шрот. Затем пища смешивается, и 15-30-минутный период равновесия включается в протокол перед потреблением. Гидропонная культура, добавляющая изотоп в питательный раствор для включения его в растение во время его роста и развития, необходима для внутренней маркировки растительных продуктов. Плюсы и минусы каждого подхода обсуждаются ниже.
Внешняя изотопная маркировка
В начале-середине 1970-х годов поглощение Fe человеком изучалось путем внешней маркировки Fe в пищевых продуктах, при этом известное количество изотопа добавлялось к известному количеству Fe в пище или пище, смешивалось и уравновешивалось в течение 15-30 мин перед измерениями. Использовались различные количества внешних изотопов, варьирующиеся от 1% до 100% внутреннего Fe, но чаще всего в диапазоне 7%-30%3. Внешняя маркировка основана на предположении, что внешний изотоп Fe полностью уравновешивается с внутренним Fe пищи или пищи. Затем измеряется поглощение внешнего изотопа, и каждый атом внешнего изотопа рассчитывается как представляющий заданное число собственных атомов Fe. Этот расчет основан на относительных молярных количествах. В 1983 году многочисленные валидационные исследования этого метода были обобщены в обзорном документе4. Валидация метода проводилась путем одновременного сравнения процента поглощения внешней изотопной метки с процентом поглощения внутренней изотопной метки. Таким образом, отношение внешней и внутренней абсорбции, близкое к 1, предполагает, что каждый пул Fe был одинаково поглощен. В то время соотношение, близкое к 1, также считалось представляющим равновесие внешнего изотопа с внутренним Fe пищи или пищи. Отношение внешнего к внутреннему поглощению Fe варьировалось от средних значений от 0,40 до 1,62 со средним (±SD) отношением 1,08 ± 0,14 в 63 сравнениях. Важно отметить, что во всех исследованиях, обобщенных в этом обзоре, ни одно из них напрямую не проверяло равновесие внешней метки с внутренним Fe. Резюмируя, авторы обзора пришли к следующему выводу:
«Метод внешней маркировки доказал свою эффективность для нескольких продуктов питания при определенных экспериментальных условиях. Но, этот метод пока нельзя считать доказанным в отношении всех видов продуктов питания. Метод внешней метки не подходит для мониторинга всасывания железа из диеты, содержащей нерастворимые формы железа. Обоснованность этого метода основывается на базовом предположении, что внешняя метка полностью обменивается со всем эндогенным негемовым пищевым железом. В настоящее время неизвестно, насколько полностью различные формы негемового железа помечены внешней меткой. Это важно в свете исследований, которые показали, что ингибиторы железа могут влиять на внешнюю метку иначе, чем некоторые формы негемового железа в пищевых продуктах. Исследования пищевых факторов, которые могут нарушить полный изотопный обмен, скудны. Таким образом, интерпретация данных о биодоступности из исследований внешних меток требует рассмотрения ингибиторов обмена, которые могут присутствовать в пище или рационе».
С 1983 года было опубликовано только два исследования, в которых оценивалась точность внешней маркировки Fe 3,5. В обоих этих исследованиях уравновешивание внешней изотопной этикетки напрямую сравнивалось с внутренним Fe продуктов, которые в этих исследованиях были основными продовольственными культурами. Были протестированы белые, красные и черные сорта бобов, а также чечевица и кукуруза. Используя установленные методы переваривания in vitro и измерение растворимости Fe и осаждения, оба исследования показали, что внешняя изотопная маркировка не всегда приводит к полному уравновешиванию, с доказательствами того, что для некоторых сортов бобов неправильное равновесие может быть очень высоким в зависимости от количества внешнего изотопа и цвета семенной оболочки3. Несмотря на выводы обзорной статьи 1983 года, исследования внешней маркировки бобов продолжались 6,7,8,9,10,11,12. Ни одно из этих исследований не включало тестирование уравновешивания внешней метки с внутренним Fe.
Встроенная маркировка
Внутренняя маркировка растительной пищи для оценки биодоступности Fe устраняет вопросы точности уравновешивания во внешней маркировке. Однако такой подход не может дать большое количество материала из-за потребности в тепличном пространстве для гидропонной культуры. Гидропонная культура является трудоемкой, требует большого количества дорогостоящего стабильного изотопа и часто приводит к росту растений, различному с точки зрения урожайности и концентрации Fe семян. Из-за стоимости внутренняя маркировка подходит только для небольших исследований, направленных на понимание механизмов, лежащих в основе поглощения Fe или факторов, влияющих на поглощение Fe из пищевых продуктов. Производство 1-2 кг основной продовольственной культуры обходится примерно в 20 000-30 000 долларов США только за материалы, в зависимости от изотопного и гидропонного подхода13,14.
Учитывая проблемы, связанные с изотопной маркировкой, исследователи стремились разработать подходы in vitro. Ранние методы использовали смоделированную желудочную и кишечную пищу в сочетании с измерением растворимости Fe или диализуемости Fe в качестве оценки биодоступности15. Такие исследования быстро обнаружили, что диализуемость Fe не является последовательной мерой биодоступности, поскольку Fe может быть растворимым, плотно связанным с соединениями и, следовательно, не подлежащим обмену, что приводит к переоценке биодоступности. Для решения этих проблем была разработана методология использования клеточной линии кишечника человека, тем самым добавив живой компонент и позволив измерить поглощение Fe16. Клетки кишечника человека – клетки Caco-2 – возникли из рака толстой кишки человека и широко использовались в исследованиях поглощения питательных веществ. Эта клеточная линия полезна, так как в культуре клетки дифференцируются в энтероциты, которые функционируют аналогично клеткам границы кисти тонкой кишки. Исследования показали, что клетки Caco-2 проявляют соответствующие транспортеры и реакцию на факторы, влияющие на поглощение Fe17,18.
Первоначальные исследования, в которых использовались радиоизотопы для измерения поглощения Fe в клетках Caco-2, были уточнены для измерения поглощения Fe на основе образования ферритина клеток Caco-2. Измерение ферритина в клетках caco-2 повысило пропускную способность образца и свело на нет проблемы обработки радиоизотопов и уравновешивания внешнего Fe с внутренним Fe19,20. Измерение поглощения fe через образование ферритина позволило исследователям изучить широкий спектр продуктов питания, включая комплексные блюда21. Таким образом, смоделированное (in vitro) пищеварение в сочетании с поглощением Fe клеток Caco-2 обеспечило лучшую физиологическую оценку поглощения Fe из пищевых продуктов. Важно отметить, что эта модель в первую очередь определяет относительные различия в биодоступности Fe. Как и многие полезные клеточные линии, клетки Caco-2 также показали изменчивость реакции, но сохранили последовательные относительные различия в поглощении Fe между продуктами. Правильная техника и тщательное внимание к деталям могут улучшить последовательный ответ на образование ферритина в клетках Caco-2.
Модель клеточного сбраживания in vitro / Caco-2 также известна как биоанализ клеток Caco-2. Этот анализ был тщательно подтвержден путем прямого сравнения с исследованиями на людях и животных22. В дополнение к прямому параллельному сравнению биоанализа с испытаниями эффективности на людях, было показано, что эта модель демонстрирует качественно аналогичную реакцию в поглощении Fe с реакцией людей 18,19,23. Поэтому, как подход in vitro, биоанализ клеток Caco-2 заслуживает высокого доверия в качестве инструмента скрининга для оценки питания Fe из пищевых продуктов. Он широко применяется к многочисленным продуктам питания и пищевым продуктам 21,24,25,26,27,28.
С момента своего создания в 1998 году биоанализ клеток Caco-2 продвинул область питания Fe, поскольку он помог выявить факторы, влияющие на поглощение кишечника Fe. При этом эта модель разработала и уточнила исследовательские цели для более окончательных и менее дорогостоящих исследований на людях. Можно также утверждать, что использование модели сводит на нет необходимость в некоторых испытаниях на людях.
Таким образом, относительная доставка Fe из пищи или пищи может быть измерена с помощью биоанализа клеток Caco-2. Независимо от количества Fe в исследуемом приеме пищи, биоанализ определяет относительное количество Fe, поглощенного энтероцитом – первой стадией процесса абсорбции. Это наиболее важный шаг в определении биодоступности Fe, так как чаще всего цель состоит в том, чтобы измерить с намерением улучшить или, по крайней мере, контролировать питательные качества Fe в пище. Учитывая, что статус железа регулируется абсорбцией, и, таким образом, поглощение Fe регулируется у людей с дефицитом Fe для удовлетворения потребностей в питании, стандартные условия модели разработаны таким образом, чтобы поглощение Fe клетками было максимальным. Таким образом, биоанализ обеспечивает истинную меру потенциала пищи для доставки Fe.
Protocol
Representative Results
Discussion
С момента его создания были опубликованы многочисленные исследования, которые описывают этот метод для биоанализа клеток Caco-2. Основные условия остались относительно неизменными со времени первоначальной публикации в 1998 году18. Однако за последние 20 лет многочисленные те?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор глубоко признателен за технические усилия Yongpei Chang и Mary Bodis. Чрезвычайно успешное применение этой модели в области питания является прямым результатом их опыта и внимания к деталям. Разработка этой модели полностью финансировалась Министерством сельского хозяйства СОЕДИНЕННЫХ Штатов, Службой сельскохозяйственных исследований.
Materials
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
References
- Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
- Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
- Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
- Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
- Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
- Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
- Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
- Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
- Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
- Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
- Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
- Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
- Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
- Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O’Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
- Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
- Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
- Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
- Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
- Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
- Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
- Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
- Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
- Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
- Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
- Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
- Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
- Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
- Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
- Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).
