Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la misurazione della biodisponibilità del ferro negli alimenti
Summary
Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità del ferro (Fe) rappresenta un approccio economico e versatile per valutare la biodisponibilità del Fe da alimenti, prodotti alimentari, integratori, pasti e persino regimi dietetici. Completamente validato per studi sull’uomo, rappresenta lo stato dell’arte per gli studi sulla biodisponibilità del Fe.
Abstract
La conoscenza della biodisponibilità del Fe è fondamentale per la valutazione della qualità nutrizionale della Fe negli alimenti. La misurazione in vivo della biodisponibilità del Fe è limitata dai costi, dalla produttività e dalle avvertenze inerenti all’etichettatura isotopica del Fe alimentare. Pertanto, esiste una necessità critica per un approccio che sia ad alto rendimento ed economico. Il biotest sulle cellule Caco-2 è stato sviluppato per soddisfare questa esigenza. Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità di Fe utilizza la digestione gastrica e intestinale simulata accoppiata con la coltura di una linea cellulare epiteliale intestinale umana nota come Caco-2. Nelle cellule Caco-2, l’assorbimento di Fe stimola la formazione intracellulare di ferritina, una proteina di stoccaggio del Fe facilmente misurabile mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). La ferritina si forma in proporzione all’assorbimento di Fe; quindi, misurando la produzione di ferritina cellulare Caco-2, è possibile valutare l’assorbimento intestinale di Fe da digerimenti alimentari simulati nell’enterocita.
Attraverso questo approccio, il modello replica il passaggio iniziale chiave che determina la biodisponibilità del Fe alimentare. Fin dal suo inizio nel 1998, questo approccio modello è stato rigorosamente confrontato con fattori noti per influenzare la biodisponibilità umana di Fe. Inoltre, è stato applicato in studi paralleli, con tre studi di efficacia umana che valutano le colture biofortificate Fe. In tutti i casi, il biotest ha previsto correttamente le quantità relative di biodisponibilità di Fe dai fattori, dalle colture e dalla dieta generale. Questo articolo fornisce metodi dettagliati sulla coltura cellulare di Caco-2 accoppiata con il processo di digestione in vitro e l’ELISA della ferritina cellulare necessari per condurre il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità di Fe.
Introduction
Per comprendere appieno la necessità di ricerca e il beneficio del saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità di Fe, è necessario prima comprendere gli approcci che erano in atto prima dell’avvento di questo modello. La misurazione della biodisponibilità del Fe da un alimento o pasto in vivo è un compito impegnativo, in particolare quando le combinazioni di alimenti devono essere valutate de un pasto o in una dieta. L’etichettatura isotopica è stato l’approccio più comune per la misurazione della biodisponibilità del Fe negli ultimi 50 anni1. L’etichettatura isotopica viene utilizzata per studi a pasto singolo e multipasto ed è poco pratica per studi a lungo termine. Gli isotopi stabili di Fe come 57Fe e 58Fe sono i più comunemente usati; tuttavia, sono stati condotti studi con radioisotopi come 59Fe, utilizzando il conteggio di tutto il corpo2. Per gli alimenti vegetali, l’etichettatura isotopica è stata effettuata tramite etichettatura estrinseca o intrinseca. Per l’etichettatura estrinseca, una quantità nota di isotopo viene aggiunta al cibo o al pasto. Il cibo viene quindi miscelato e un periodo di equilibrio di 15-30 minuti viene incorporato nel protocollo prima del consumo. La coltura idroponica – aggiungendo l’isotopo alla soluzione nutritiva per incorporarla nella pianta mentre cresce e si sviluppa – è necessaria per l’etichettatura intrinseca degli alimenti vegetali. I pro e i contro di ciascun approccio sono discussi di seguito.
Etichettatura isotopica estrinseca
Nella prima metà degli anni 1970, l’assorbimento umano di Fe è stato studiato mediante etichettatura estrinseca di Fe negli alimenti, in cui una quantità nota di isotopo viene aggiunta alla quantità nota di Fe nel cibo o nel pasto, miscelata ed equilibrata per 15-30 minuti prima delle misurazioni. Sono state utilizzate varie quantità di isotopi estrinseci, che vanno dall’1% al 100% del Fe intrinseco, ma più comunemente nell’intervallo 7%-30%3. L’etichettatura estrinseca si basa sul presupposto che l’isotopo Fe estrinseco sia completamente equilibrato con il Fe intrinseco del cibo o del pasto. Viene quindi misurato l’assorbimento isotopico estrinseco e ogni atomo dell’isotopo estrinseco viene calcolato per rappresentare un dato numero di atomi di Fe intrinseci. Questo calcolo si basa sulle quantità molari relative. Nel 1983, diversi studi di convalida della tecnica sono stati riassunti in un documento di revisione4. La convalida della tecnica è stata effettuata confrontando simultaneamente l’assorbimento percentuale dell’etichetta isotopica estrinseca con l’assorbimento percentuale di un’etichetta isotopica intrinseca. Pertanto, un rapporto tra l’assorbimento estrinseco e quello intrinseco vicino a 1 suggerisce che ogni pool di Fe è stato ugualmente assorbito. All’epoca, un rapporto vicino a 1 era anche considerato rappresentare l’equilibrio dell’isotopo estrinseco con il Fe intrinseco del cibo o del pasto. I rapporti tra assorbimento estrinseco e intrinseco di Fe variavano da valori medi di 0,40 a 1,62, con un rapporto medio (±SD) di 1,08 ± 0,14 in 63 confronti. È importante notare che, in tutti gli studi riassunti in questa recensione, nessuno ha testato direttamente l’equilibrio dell’etichetta estrinseca con il Fe intrinseco. In sintesi, gli autori della revisione hanno concluso quanto segue:
“La tecnica del tag estrinseco si è dimostrata valida per diversi alimenti in determinate condizioni sperimentali. Ma questo metodo non può ancora essere considerato provato per quanto riguarda tutti i tipi di alimenti. Il metodo del tag estrinseco non è appropriato per monitorare l’assorbimento del ferro da una dieta che contiene forme insolubili di ferro. La validità di questa tecnica si basa sul presupposto di base che il tag estrinseco si scambia completamente con tutto il ferro alimentare nonheme endogeno. Al momento non è noto quanto completamente le diverse forme di ferro nonheme siano etichettate da un tag estrinseco. Questo è importante alla luce di studi che hanno suggerito che gli inibitori del ferro possono influenzare il tag estrinseco in modo diverso rispetto ad alcune forme di ferro nonheme negli alimenti. La ricerca sui fattori alimentari che possono compromettere uno scambio isotopico completo è scarsa. Pertanto, l’interpretazione dei dati di biodisponibilità dalla ricerca sui tag estrinseci richiede la considerazione degli inibitori dello scambio che possono essere presenti nel cibo o nella dieta”.
Dal 1983 sono stati pubblicati solo due studi che hanno valutato l’accuratezza dell’etichettatura estrinseca di Fe 3,5. In entrambi questi studi, l’equilibrio di un’etichetta isotopica estrinseca è stato direttamente confrontato con il Fe intrinseco degli alimenti, che, in questi studi, erano colture alimentari di base. Sono state testate varietà di fagioli bianchi, rossi e neri, insieme a lenticchie e mais. Utilizzando tecniche di digestione in vitro consolidate e la misurazione della solubilità e della precipitazione del Fe, entrambi gli studi hanno dimostrato che l’etichettatura isotopica estrinseca non porta costantemente a un completo equilibrio, con evidenza che, per alcune varietà di fagioli, il disequilibrio può essere molto elevato a seconda della quantità di isotopo estrinseco e del colore del rivestimento del seme3. Nonostante le conclusioni del documento di revisione del 1983, gli studi di etichettatura estrinseca dei fagioli sono continuati 6,7,8,9,10,11,12. Nessuno di questi studi includeva la verifica dell’equilibrio dell’etichetta estrinseca con il Fe intrinseco.
Etichettatura intrinseca
L’etichettatura intrinseca degli alimenti vegetali per la valutazione della biodisponibilità del Fe elimina i problemi di accuratezza dell’equilibrio nell’etichettatura estrinseca. Tuttavia, questo approccio non può produrre grandi quantità di materiale a causa della necessità di spazio in serra per la coltura idroponica. La coltura idroponica è laboriosa, richiede un’elevata quantità di isotopi stabili costosi e spesso si traduce in una crescita delle piante diversa in termini di resa e concentrazione di Fe del seme. A causa del costo, l’etichettatura intrinseca è adatta solo per studi su piccola scala volti a comprendere i meccanismi alla base dell’assorbimento di Fe o i fattori che influenzano l’assorbimento di Fe dagli alimenti. La produzione di 1-2 kg di una coltura alimentare di base costa circa $ 20.000- $ 30.000 per i soli materiali, a seconda dell’isotopo e dell’approccio idroponico13,14.
Date le sfide associate all’etichettatura isotopica, i ricercatori hanno cercato di sviluppare approcci in vitro. I primi metodi utilizzavano alimenti gastrici e intestinali simulati, accoppiati con la misurazione della solubilità di Fe o della dializzabilità di Fe come stima della biodisponibilità15. Tali studi hanno rapidamente scoperto che la dializzabilità del Fe non era una misura coerente della biodisponibilità in quanto la Fe può essere solubile, strettamente legata ai composti e, quindi, non scambiabile, portando alla sovrastima della biodisponibilità. Per affrontare questi problemi, la metodologia per utilizzare una linea cellulare intestinale umana si è evoluta, aggiungendo così un componente vivente e consentendo la misurazione dell’assorbimento di Fe16. Le cellule intestinali umane – cellule Caco-2 – hanno avuto origine da un carcinoma del colon umano e sono state ampiamente utilizzate negli studi sull’assorbimento dei nutrienti. Questa linea cellulare è utile in quanto, in coltura, le cellule si differenziano in enterociti che funzionano in modo simile alle cellule del bordo del pennello dell’intestino tenue. Gli studi hanno dimostrato che le cellule Caco-2 mostrano i trasportatori appropriati e la risposta ai fattori che influenzano l’assorbimento di Fe17,18.
Gli studi iniziali, utilizzando radioisotopi per misurare l’assorbimento di Fe nelle cellule Caco-2, sono stati perfezionati per misurare l’assorbimento di Fe sulla base della formazione di ferritina cellulare Caco-2. La misurazione della ferritina cellulare Caco-2 ha migliorato la produttività del campione e ha annullato i problemi di gestione dei radioisotopi e l’equilibrio del Fe estrinseco con Fe intrinseco19,20. La misurazione dell’assorbimento di Fe attraverso la formazione di ferritina ha permesso ai ricercatori di studiare una vasta gamma di alimenti, compresi i pasti complessi21. Pertanto, la digestione simulata (in vitro) accoppiata con l’assorbimento di Fe delle cellule Caco-2 ha fornito una migliore valutazione fisiologica dell’assorbimento di Fe dagli alimenti. È importante notare che questo modello determina principalmente differenze relative nella biodisponibilità di Fe. Come molte linee cellulari utili, anche le cellule Caco-2 hanno mostrato variabilità nella reattività, ma hanno mantenuto differenze relative consistenti nell’assorbimento di Fe tra gli alimenti. Una tecnica corretta e un’attenta attenzione ai dettagli possono migliorare la risposta coerente alla formazione di ferritina cellulare nelle cellule Caco-2.
Il modello di digestione in vitro / cellule Caco-2 è anche noto come test biologico delle cellule Caco-2. Questo test è stato accuratamente convalidato mediante confronto diretto con studi sull’uomo e sugli animali22. Oltre al confronto parallelo diretto del saggio biologico con gli studi di efficacia umana, questo modello ha dimostrato di mostrare una risposta qualitativamente simile nell’assorbimento di Fe a quella degli esseri umani18,19,23. Pertanto, come approccio in vitro, il biotest sulle cellule Caco-2 garantisce un’elevata credibilità come strumento di screening per valutare la nutrizione di Fe dagli alimenti. È stato ampiamente applicato a numerosi alimenti e prodotti alimentari 21,24,25,26,27,28.
Fin dal suo inizio nel 1998, il biotest sulle cellule Caco-2 ha fatto progredire il campo della nutrizione del Fe in quanto ha contribuito a identificare i fattori che influenzano l’assorbimento intestinale di Fe. In tal modo, questo modello ha sviluppato e perfezionato obiettivi di ricerca per studi umani più definitivi e meno costosi. Si potrebbe anche sostenere che l’uso del modello nega la necessità di alcune sperimentazioni umane.
In sintesi, la consegna relativa di Fe da un alimento o pasto può essere misurata con il biotest cellulare Caco-2. Indipendentemente dalla quantità di Fe nel pasto di prova, il biotest definisce la quantità relativa di Fe assorbita nell’enterocita, la prima fase del processo di assorbimento. Questo è il passo più importante nella definizione della biodisponibilità del Fe, poiché il più delle volte l’obiettivo è misurare con l’intento di migliorare o, per lo meno, monitorare la qualità nutrizionale del Fe in un alimento. Dato che lo stato del ferro è regolato dall’assorbimento, e quindi l’assorbimento di Fe è sovraregolato in individui carenti di Fe per soddisfare le esigenze nutrizionali, le condizioni standard del modello sono progettate in modo che l’assorbimento di Fe da parte delle cellule sia massimo. In questo modo, il saggio biologico fornisce una vera misura del potenziale del cibo per fornire Fe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fin dal suo inizio, sono stati pubblicati numerosi studi che descrivono questo metodo per il biotest delle cellule Caco-2. Le condizioni di base sono rimaste relativamente invariate dalla pubblicazione iniziale nel 199818. Tuttavia, negli ultimi 20 anni, numerosi dettagli tecnici sono stati perfezionati e standardizzati per produrre una coerenza senza precedenti nella risposta del saggio biologico. Un’aderenza attenta e precisa alla coltura cellulare e alle condizioni di digestione in vitro</e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’autore è profondamente grato per gli sforzi tecnici di Yongpei Chang e Mary Bodis. L’applicazione estremamente riuscita di questo modello nel campo della nutrizione è il risultato diretto della loro esperienza e attenzione ai dettagli. Lo sviluppo di questo modello è stato finanziato interamente dal Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti, Servizio di ricerca agricola.
Materials
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
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