Detección de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans

Summary

Los microbios intestinales pueden afectar positiva o negativamente la salud de su huésped a través de mecanismos específicos o conservados. Caenorhabditis elegans es una plataforma conveniente para detectar tales microbios. El presente protocolo describe el cribado de alto rendimiento de 48 aislados bacterianos para determinar su impacto en la resistencia al estrés de los nematodos, utilizados como sustitutos de la salud de los gusanos.

Abstract

Con su pequeño tamaño, corta vida útil y genética fácil, Caenorhabditis elegans ofrece una plataforma conveniente para estudiar el impacto de los aislados microbianos en la fisiología del huésped. También fluoresce en azul cuando muere, proporcionando un medio conveniente para identificar la muerte. Esta propiedad se ha explotado para desarrollar ensayos de supervivencia de C. elegans (LFASS) de alto rendimiento y sin etiquetas. Estos implican el registro de fluorescencia de lapso de tiempo de poblaciones de gusanos colocadas en placas de múltiples pocillos, de las cuales se puede derivar el tiempo medio de muerte de la población. El presente estudio adopta el enfoque LFASS para detectar múltiples aislados microbianos a la vez para detectar los efectos sobre la susceptibilidad de C. elegans al calor severo y al estrés oxidativo. Aquí se informa de esta tubería de detección microbiana, que se puede utilizar en particular para preseleccionar probióticos, utilizando resistencia severa al estrés como un indicador de la salud del huésped. El protocolo describe cómo cultivar colecciones aisladas de microbiota intestinal de C. elegans y poblaciones de gusanos sincrónicos en matrices de pozos múltiples antes de combinarlos para los ensayos. El ejemplo proporcionado cubre la prueba de 47 aislados bacterianos y una cepa de control en dos cepas de gusanos, en dos ensayos de estrés en paralelo. Sin embargo, la tubería de enfoque es fácilmente escalable y aplicable a la selección de muchas otras modalidades. Por lo tanto, proporciona una configuración versátil para estudiar rápidamente un paisaje multiparamétrico de condiciones biológicas y bioquímicas que afectan la salud de C. elegans.

Introduction

El cuerpo humano alberga un estimado de 10-100 billones de células microbianas vivas (bacterias, hongos arquea), que se encuentran principalmente en el intestino, la piel y los ambientes de la mucosa¹. En un estado saludable, estos proporcionan beneficios a su huésped, incluida la producción de vitaminas, la maduración del sistema inmunológico, la estimulación de las respuestas inmunes innatas y adaptativas a los patógenos, la regulación del metabolismo de las grasas, la modulación de las respuestas al estrés y más, con un impacto en el crecimiento y el desarrollo, el inicio de la enfermedad y el envejecimiento 2,3,4,5 . La microbiota intestinal también evoluciona considerablemente a lo largo de la vida. La evolución más drástica ocurre durante la infancia y la primera infancia⁶, pero también ocurren cambios significativos con la edad, incluyendo una disminución en la abundancia de Bifidobacterium y un aumento en las especies de Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae y Enterococcus ⁷. El estilo de vida puede alterar aún más la composición microbiana intestinal que conduce a la disbiosis (pérdida de bacterias beneficiosas, crecimiento excesivo de bacterias oportunistas), lo que resulta en diversas patologías como la enfermedad inflamatoria intestinal, la diabetes y la obesidad⁵, pero también contribuye a las enfermedades de Alzheimer y Parkinson 8,9,10,11.

Esta comprensión ha contribuido críticamente a refinar el concepto del eje intestino-cerebro (GBA), donde las interacciones entre la fisiología intestinal (ahora incluyendo los microbios dentro de ella) y el sistema nervioso se consideran el principal regulador del metabolismo animal y las funciones fisiológicas¹². Sin embargo, el papel preciso de la microbiota en la señalización intestino-cerebro y los mecanismos de acción asociados están lejos de ser completamente comprendidos¹³. Dado que la microbiota intestinal es un determinante clave del envejecimiento saludable, la forma en que las bacterias modulan el proceso de envejecimiento se ha convertido en un tema de intensa investigación y controversia 6,14,15.

Con la demostración de que el gusano redondo Caenorhabditis elegans alberga una microbiota intestinal de buena fe dominada, como en otras especies, por Bacteroidetes, Firmicutes y Actinobacteria 16,17,18,19,20, su rápido aumento como plataforma experimental para estudiar las interacciones comensales huésped-intestino^21,22,23,24 ,^25,26 ha ampliado significativamente nuestro arsenal de investigación^26,27,28,29. En particular, los enfoques experimentales de alto rendimiento disponibles para que C. elegans estudien las interacciones gen-dieta, gen-fármaco, gen-patógeno, etc., se pueden adaptar para explorar rápidamente cómo los aislados bacterianos y los cócteles afectan la salud y el envejecimiento de C. elegans.

El presente protocolo describe una tubería experimental para examinar a la vez matrices de aislados o mezclas bacterianas colocadas en placas de múltiples pocillos para detectar efectos sobre la resistencia al estrés de C. elegans como un indicador de la salud, que puede usarse para identificar probióticos. Detalla cómo cultivar grandes poblaciones de gusanos y manejar matrices bacterianas en formatos de placas de 96 y 384 pocillos antes de procesar gusanos para el análisis automatizado de resistencia al estrés utilizando un lector de placas de fluorescencia (Figura 1). El enfoque se basa en ensayos automatizados de supervivencia sin etiquetas (LFASS)³⁰ que explotan el fenómeno de la fluorescencia de muerte³¹, mediante el cual los gusanos moribundos producen una explosión de fluorescencia azul que puede usarse para determinar el momento de la muerte. La fluorescencia azul es emitida por ésteres glucosílicos de ácido antranílico almacenados en gránulos intestinales de C. elegans (un tipo de orgánulo relacionado con lisosomas), que estallan cuando se desencadena una cascada necrótica en el intestino del gusano al morir³¹.

Figura 1: Flujo de trabajo experimental para el cribado de alto rendimiento de aislados bacterianos con impacto en la resistencia de C. elegans al estrés . (A) Línea de tiempo para el mantenimiento de gusanos y bacterias y la configuración del ensayo. (B) Configuración y manejo de la matriz de placas bacterianas de 96 pocillos. (C) Configuración de placa de tornillo sin fin de 384 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Las dos cepas de C. elegans utilizadas en paralelo para el presente estudio fueron Bristol N2 wild type y HT1890: daf-16(mgDf50), que crecen a tasas similares. Sin embargo, el protocolo se puede replicar con cualquier combinación de dos cepas que tengan tasas de crecimiento similares. Tenga en cuenta que, al probar otras cepas en paralelo (por ejemplo, mutantes daf-2 de tipo salvaje y de crecimiento lento), se deben considerar diferentes tasas de crecimiento y, en consecuencia, se debe ajustar…

Representative Results

Los ensayos LFASS proporcionan una detección robusta, de alto rendimiento y rápida de múltiples condiciones de prueba a la vez, como la detección de numerosos parámetros genéticos y de microbiota que contribuyen a la resistencia al estrés y al envejecimiento. Solo toma 2-3 semanas para que el experimento adquiera un extenso conjunto de datos de múltiples condiciones de prueba. Las poblaciones de gusanos adultos de tipo salvaje L4 + 36 h fueron expuestas a 42 °C de estrés térmico y 7% de estrés oxidat…

Discussion

C. elegans ofrece muchas ventajas para examinar rápidamente múltiples parámetros experimentales a la vez, debido a su pequeño tamaño, transparencia, rápido desarrollo, corta vida útil, bajo costo y facilidad de manejo. Su genoma, plan corporal, sistema nervioso, intestino y microbioma considerablemente más simples, pero lo suficientemente complejos y similares a los humanos, lo convierten en un poderoso modelo preclínico, donde se puede obtener una visión mecanicista mientras se prueba la eficacia o to…

Materials

10 cm diameter plates (Non-vented)	Fisher Scientific	10720052	Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	168381
384-well black, transparent flat bottom plates	Corning	3712 or 3762	Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	150288	Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite)	Thermo	130188
Agar (<4% ash)	Sigma-Aldrich	102218041	Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP	Beckman coulter
Bleach	Honeywell	425044
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5080
Centrifuge 5415 R	Eppendorf
Centrifuge 5810 R	Eppendorf
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
LB agar	Difco	240110
LB broth	Invitrogen	12795084
LoBind tips	VWR	732-1488	Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes	Eppendorf	22431081
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+	Tecan		Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark	Tecan
Potassium phosphate monobasic	Honeywell	P0662
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base	Leica	MZ6, or M80	Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide)	Sigma-Aldrich	458139
Transparent adhesive seals Nunc	Fisher Scientific	101706871	It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan	Sigma-Aldrich	1278-7099
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422