الوسم المناعي والعد المشبك الشريطي في قوقعة الجربيل لدى الشباب والمسنين
Summary
يتم تقديم بروتوكول لمعالجة قوقعة الجربيل لدى البالغين والمسنين عن طريق وضع العلامات المناعية على الهياكل المشبكية وخلايا الشعر ، وإخماد التألق الذاتي في الأنسجة القديمة ، وتشريح وتقدير طول القوقعة ، وتحديد نقاط الاشتباك العصبي في أكوام الصور التي تم الحصول عليها باستخدام التصوير البؤري.
Abstract
يفترض أن فقدان نقاط الاشتباك العصبي الشريطية التي تربط خلايا الشعر الداخلية والألياف العصبية السمعية القريبة هو أحد أسباب فقدان السمع المرتبط بالعمر. الطريقة الأكثر شيوعا للكشف عن فقدان نقاط الاشتباك العصبي الشريطية هي وضع العلامات المناعية لأنها تسمح بأخذ العينات الكمية من عدة مواقع تونوتوبية في قوقعة واحدة. ومع ذلك ، يتم دفن الهياكل ذات الأهمية في عمق القوقعة العظمية. تستخدم الجربلات كنموذج حيواني لفقدان السمع المرتبط بالعمر. هنا ، يتم وصف البروتوكولات الروتينية للتثبيت ، ووضع العلامات المناعية على حوامل القوقعة الصناعية الجربيل ، والتصوير البؤري ، وتحديد أعداد وأحجام المشبك الشريطي كميا. علاوة على ذلك ، يتم تسليط الضوء على التحديات الخاصة المرتبطة بالحصول على مواد جيدة من الأفراد المسنين القيمين.
يتم قتل الجربلات بالقتل الرحيم وإما أن يتم تأديلها عن طريق القلب والأوعية الدموية ، أو يتم تشريح الفقاعات الطبلية بعناية من الجمجمة. يتم فتح القوقعة في القمة والقاعدة ونقلها مباشرة إلى المثبت. بغض النظر عن الطريقة الأولية ، يتم تثبيت القوقعة بعد ذلك ثم إزالة الكلس. ثم يتم تصنيف الأنسجة بأجسام مضادة أولية ضد الهياكل والخلايا الشعرية قبل وبعد المشبكي. بعد ذلك ، يتم احتضان القوقعة بأجسام مضادة ثانوية موسومة بالتألق تكون محددة ضد الأجسام المضادة الأولية الخاصة بكل منها. ثم يتم التعامل مع قوقعة الأذن من الجربلات المسنة باستخدام مبرد التألق الذاتي لتقليل التألق الخلفي الكبير عادة لأنسجة الحيوانات الأكبر سنا.
أخيرا ، يتم تشريح القوقعة إلى 6-11 جزءا. يتم إعادة بناء طول القوقعة الصناعية بالكامل بحيث يمكن تحديد مواقع قوقعة صناعية محددة بشكل موثوق بين الأفراد. تساعد مكدسات الصور البؤرية ، التي يتم الحصول عليها بالتتابع ، على تصور خلايا الشعر ونقاط الاشتباك العصبي في المواقع المختارة. يتم فك المكدسات متحدة البؤرة ، ويتم حساب نقاط الاشتباك العصبي إما يدويا باستخدام ImageJ ، أو يتم إجراء تحديد كمي أكثر شمولا للهياكل المشبكية باستخدام إجراءات تحليل الصور المكتوبة خصيصا في Matlab.
Introduction
فقدان السمع المرتبط بالعمر هو واحد من أكثر الأمراض انتشارا في العالم التي تؤثر على أكثر من ثلث سكان العالم الذين تتراوح أعمارهم بين 65 سنة وما فوق1. لا تزال الأسباب الكامنة وراء ذلك قيد النقاش ويجري التحقيق فيها بنشاط ولكنها قد تشمل فقدان نقاط الاشتباك العصبي المتخصصة التي تربط خلايا الشعر الداخلية (IHCs) بالألياف العصبية السمعيةالقريبة 2. تتكون هذه المشابك الشريطية من بنية ما قبل المشبكي تحتوي على حويصلات مملوءة بغلوتامات الناقل العصبي المربوطة بها ، بالإضافة إلى مستقبلات الغلوتامات α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA)بعد المشبكي 3,4,5. في الجربيل ، ~ 20 من الألياف العصبية السمعية القريبة الاتصال واحد IHC 6,7,8. وتعارض الألياف الموجودة على المدينة العالمية للخدمات الإنسانية التي تواجه الموديولوس الشرائط المشبكية الكبيرة، في حين أن الألياف المتصلة على جانب العمود من المدينة العالمية للخدمات الإنسانية تواجه شرائط متشابكة صغيرة (أي في القطط9، والجربلات7، وخنازير غينيا10، والفئران3،11،12،13،14). علاوة على ذلك ، في الجربيل ، يرتبط حجم الشرائط قبل المشبكي وبقع الغلوتامات ما بعد المشبكي ارتباطا إيجابيا 7,14. الألياف التي تعارض الشرائط الكبيرة على الجانب المعياري من المدينة العالمية للخدمات الإنسانية صغيرة في العيار ولها معدلات عفوية منخفضة وعتبات عالية15. هناك أدلة على أن الألياف ذات المعدل التلقائي المنخفض أكثر عرضة للتعرض للضوضاء10 والأدوية السامة للأذن 16 من الألياف منخفضة العتبة عالية العفوية ، والتي تقع على جانب العمود من IHCs15.
فقدان نقاط الاشتباك العصبي الشريطية هو أقرب حدث تنكسي في فقدان السمع العصبي المرتبط بالعمر القوقعي ، في حين أن فقدان الخلايا العقدية الحلزونية وأليافها العصبية السمعية المرتبطة بها يتخلف عن17,18. تشمل الارتباطات الكهروفسيولوجية تسجيلات استجابات جذع الدماغ السمعية17 وإمكانات العمل المركب8 ؛ ومع ذلك ، فإن هذه لا تعكس التفاصيل الدقيقة لفقدان المشبك العصبي ، لأن الألياف ذات المعدل التلقائي المنخفض لا تساهم في هذه التدابير16. المقاييس الكهروفسيولوجية الكهربية الواعدة هي المؤشر العصبي المشتق من جهد الكتلة19 والاستجابة الزمنية المحيطة بالتحفيز20. ومع ذلك ، لا يمكن الاعتماد عليها إلا إذا لم يكن لدى الحيوان أمراض قوقعة الأذن الأخرى ، بخلاف فقدان الألياف العصبية السمعية ، والتي تؤثر على نشاط الألياف العصبية السمعية المتبقية8. علاوة على ذلك ، لم تكن العتبات التي تم تقييمها سلوكيا في الجربيل مرتبطة بأرقام المشبك21. لذلك ، لا يمكن الاعتماد على القياس الكمي لنقاط الاشتباك العصبي الشريطية الباقية على قيد الحياة ، وبالتالي ، فإن عدد الألياف العصبية السمعية الوظيفية لا يمكن تحقيقه إلا من خلال الفحص المباشر لأنسجة القوقعة الصناعية.
الجربيل المنغولي (Meriones unguiculatus) هو نموذج حيواني مناسب لدراسة فقدان السمع المرتبط بالعمر. له عمر افتراضي قصير ، ولديه سمع منخفض التردد مشابه للبشر ، وسهل الصيانة ، ويظهر أوجه تشابه مع الأمراض البشرية المتعلقة بفقدان السمع المرتبط بالعمر2،22،23،24. تعتبر الجربلات مسنة عندما تصل إلى 36 شهرا من العمر ، وهو ما يقرب من نهاية متوسط عمرهاالافتراضي 22. الأهم من ذلك ، تم إثبات فقدان مرتبط بالعمر من نقاط الاشتباك العصبي الشريطية في الجربلات التي تم تربيتها وعمرها في بيئات هادئة 8,21.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول للتسمية المناعية ، وتشريح ، وتحليل القوقعة من الجربلات من مختلف الأعمار ، من الشباب إلى كبار السن. يتم استخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد مكونات ما قبل المشبك (CtBP2) ، وبقع مستقبلات الغلوتامات بعد المشبكية (GluA2) ، و IHCs (myoVIIa). يتم تطبيق مبرد التألق الذاتي الذي يقلل من الخلفية في القوقعة القديمة ويترك إشارة التألق سليمة. علاوة على ذلك ، يتم إعطاء وصف لكيفية تشريح القوقعة لفحص كل من الظهارة الحسية والأوعية الدموية stria. يتم قياس طول القوقعة الصناعية لتمكين اختيار مواقع القوقعة الصناعية المتميزة التي تتوافق مع أفضل الترددات المحددة25. يتم إجراء القياس الكمي لأرقام المشبك باستخدام البرنامج المتاح مجانا ImageJ26. يتم إجراء تقدير كمي إضافي لأحجام ومواقع المشبك داخل HC الفردي باستخدام برنامج مخصص مكتوب في Matlab. لا يتم توفير هذا البرنامج للجمهور ، حيث يفتقر المؤلفون إلى الموارد اللازمة لتوفير الوثائق المهنية والدعم.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول ، من الممكن وضع علامة مناعية على IHCs والهياكل المشبكية في القوقعة من الجربلات الشابة والمسنين ، وتحديد نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية المفترضة عن طريق التوطين المشترك للعناصر قبل وبعد المشبكي ، وتخصيصها إلى IHCs الفردية ، وتحديد عددها وحجمها وموقع…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بليشون تشانغ للمساعدة في إنشاء الطريقة ووحدة خدمة الفحص المجهري الفلوري ، جامعة كارل فون أوسيتسكي في أولدنبورغ ، لاستخدام مرافق التصوير. تم تمويل هذا البحث من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG، مؤسسة الأبحاث الألمانية) في إطار استراتيجية التميز الألمانية -EXC 2177/1.
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -. S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O’Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neurosciences. 407, 8-20 (2019).
