Immunmarkierung und Zählbandsynapsen bei jungen Erwachsenen und älteren Rennmaus-Cochleae
Summary
Es wird ein Protokoll zur Verarbeitung von Cochleae für junge Erwachsene und ältere Rennmäuse durch Immunmarkierung der afferenten synaptischen Strukturen und Haarzellen, Abschreckung der Autofluoreszenz in gealtertem Gewebe, Sezieren und Abschätzen der Länge der Cochleae und Quantifizierung der Synapsen in Bildstapeln vorgestellt, die mit konfokaler Bildgebung erhalten wurden.
Abstract
Es wird angenommen, dass der Verlust von Bandsynapsen, die innere Haarzellen und afferente Hörnervenfasern verbinden, eine Ursache für altersbedingten Hörverlust ist. Die gebräuchlichste Methode zum Nachweis des Verlustes von Bandsynapsen ist die Immunmarkierung, da sie eine quantitative Probenahme von mehreren tonotopischen Stellen in einer einzelnen Cochlea ermöglicht. Die interessierenden Strukturen sind jedoch tief im Inneren der knöchernen Cochlea vergraben. Rennmäuse werden als Tiermodell für altersbedingten Hörverlust verwendet. Hier werden Routineprotokolle für die Fixierung, die Immunmarkierung von Gerbil-Cochlea-Ganzkörpern, konfokale Bildgebung und die Quantifizierung von Bandsynapsenzahlen und -volumina beschrieben. Darüber hinaus werden die besonderen Herausforderungen hervorgehoben, die mit der Beschaffung von gutem Material von wertvollen alternden Menschen verbunden sind.
Rennmäuse werden eingeschläfert und entweder kardiovaskulär durchblutet, oder ihre Paukenfelle werden vorsichtig aus dem Schädel seziert. Die Cochleae werden an der Spitze und Basis geöffnet und direkt auf das Fixiermittel übertragen. Unabhängig von der Ausgangsmethode werden die Cochleae postfixiert und anschließend entkalkt. Das Gewebe wird dann mit primären Antikörpern gegen prä- und postsynaptische Strukturen und Haarzellen markiert. Als nächstes werden die Cochleae mit sekundären fluoreszenzmarkierten Antikörpern inkubiert, die spezifisch gegen ihre jeweiligen primären Antikörper sind. Die Cochleae gealterter Rennmäuse werden dann mit einem Autofluoreszenz-Quencher behandelt, um die typischerweise erhebliche Hintergrundfluoreszenz älterer Tiergewebe zu reduzieren.
Schließlich werden Cochleae in 6-11 Segmente zerlegt. Die gesamte Cochlea-Länge wird so rekonstruiert, dass bestimmte Cochlea-Stellen zuverlässig zwischen Individuen bestimmt werden können. Konfokale Bildstapel, die sequentiell aufgenommen werden, helfen, Haarzellen und Synapsen an den ausgewählten Stellen zu visualisieren. Die konfokalen Stapel werden dekonvolutiert, und die Synapsen werden entweder manuell mit ImageJ gezählt, oder eine umfangreichere Quantifizierung synaptischer Strukturen wird mit Bildanalyseverfahren durchgeführt, die speziell in Matlab geschrieben wurden.
Introduction
Altersbedingter Hörverlust ist eine der weltweit am weitesten verbreiteten Krankheiten, von der mehr als ein Drittel der Weltbevölkerung im Alter von 65 Jahren und älter betroffenist 1. Die zugrunde liegenden Ursachen werden noch diskutiert und aktiv untersucht, können aber den Verlust der spezialisierten Synapsen umfassen, die innere Haarzellen (IHCs) mit afferenten Hörnervenfasern verbinden2. Diese Bandsynapsen bestehen aus einer präsynaptischen Struktur, an die Vesikel mit dem daran gebundenen Neurotransmitter Glutamat gefüllt sind, sowie aus postsynaptischen α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure (AMPA)-Glutamatrezeptoren 3,4,5. In der Rennmaus berühren ~ 20 afferente Hörnervenfasern eine IHC 6,7,8. Fasern auf dem IHC, die dem Modiolus zugewandt sind, stehen großen synaptischen Bändern gegenüber, während die Fasern, die sich auf der Säulenseite des IHC verbinden, kleinen synaptischen Bändern gegenüberstehen (dh bei Katzen9, Rennmäusen7, Meerschweinchen 10 und Mäusen 3,11,12,13,14). Darüber hinaus sind bei der Rennmaus die Größe der präsynaptischen Bänder und der postsynaptischen Glutamatflecken positiv korreliert 7,14. Fasern, die großen Bändern auf der modiolären Seite des IHC entgegengesetzt sind, sind kleinkalibrig und haben niedrige spontane Raten und hohe Schwellen15. Es gibt Hinweise darauf, dass Fasern mit niedriger spontaner Rateanfälliger für Lärmexposition 10 und ototoxische Medikamente 16 sind als hochspontane niedrigschwellige Fasern, die sich auf der Säulenseite von IHCs15 befinden.
Der Verlust von Bandsynapsen ist das früheste degenerative Ereignis bei altersbedingtem Hörverlust im Cochlea-Neuralbereich, während der Verlust von Spiralganglionzellen und ihren afferenten Hörnervenfasern hinter17,18 zurückbleibt. Elektrophysiologische Korrelate umfassen Aufzeichnungen von auditiven Hirnstammreaktionen17 und zusammengesetzten Aktionspotentialen8; Diese spiegeln jedoch nicht die Feinheiten des Synapsenverlustes wider, da Fasern mit niedriger spontaner Rate nicht zu diesen Maßnahmen beitragen16. Weitere vielversprechende elektrophysiologische Metriken sind der vom Massenpotential abgeleitete neuronale Index19 und die peristimulus time response20. Diese sind jedoch nur dann zuverlässig, wenn das Tier keine anderen Cochlea-Pathologien hat, abgesehen vom Verlust der Hörnervenfasern, die die Aktivität der verbleibenden Hörnervenfasern beeinflussen8. Darüber hinaus wurden verhaltensbezogene Schwellenwerte in der Rennmaus nicht mit Synapsenzahlen21 korreliert. Eine zuverlässige Quantifizierung der überlebenden Bandsynapsen und damit der Anzahl der funktionellen Hörnervenfasern ist daher nur durch direkte Untersuchung des Cochlea-Gewebes möglich.
Die Mongolische Rennmaus (Meriones unguiculatus) ist ein geeignetes Tiermodell zur Untersuchung von altersbedingtem Hörverlust. Es hat eine kurze Lebensdauer, hat ein niederfrequentes Gehör ähnlich dem Menschen, ist leicht zu pflegen und zeigt Ähnlichkeiten mit menschlichen Pathologien im Zusammenhang mit altersbedingtem Hörverlust 2,22,23,24. Rennmäuse gelten als gealtert, wenn sie 36 Monate alt sind, was dem Ende ihrer durchschnittlichen Lebensdauervon 22 entspricht. Wichtig ist, dass ein altersbedingter Verlust von Bandsynapsen bei Rennmäusen nachgewiesen wurde, die in ruhigen Umgebungen aufgezogen und gealtert sind 8,21.
Hier wird ein Protokoll zur Immunmarkierung, Sezierung und Analyse von Cochleae von Rennmäusen unterschiedlichen Alters, von jungen Erwachsenen bis zu älteren Menschen, vorgestellt. Antikörper, die gegen Komponenten der Präsynapse (CtBP2), postsynaptische Glutamatrezeptorpflaster (GluA2) und IHCs (myoVIIa) gerichtet sind, werden verwendet. Es wird ein Autofluoreszenz-Quencher angewendet, der den Hintergrund in gealterten Cochleae reduziert und das Fluoreszenzsignal intakt lässt. Weiterhin wird beschrieben, wie die Cochlea zu sezieren ist, um sowohl das sensorische Epithel als auch die Stria vascularis zu untersuchen. Die Cochlea-Länge wird gemessen, um die Auswahl verschiedener Cochlea-Positionen zu ermöglichen, die bestimmten besten Frequenzenentsprechen 25. Die Quantifizierung von Synapsenzahlen erfolgt mit der frei verfügbaren Software ImageJ26. Eine zusätzliche Quantifizierung von Synapsenvolumina und -positionen innerhalb des einzelnen HC erfolgt mit einer in Matlab benutzerdefinierten Software. Diese Software wird nicht öffentlich zugänglich gemacht, da den Autoren die Ressourcen fehlen, um professionelle Dokumentation und Unterstützung bereitzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit der in diesem Protokoll beschriebenen Methode ist es möglich, IHCs und synaptische Strukturen in Cochleae von jungen erwachsenen und gealterten Rennmäusen zu immunisieren, vermutete funktionelle Synapsen durch Kolokalisierung prä- und postsynaptischer Elemente zu identifizieren, sie einzelnen IHCs zuzuordnen und ihre Anzahl, ihr Volumen und ihre Position zu quantifizieren. Die bei diesem Ansatz verwendeten Antikörper markierten auch äußere Haarzellen (OHCs; myoVIIa) und ihre präsynaptischen Bänder. Darüber …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Lichun Zhang für die Hilfe bei der Etablierung der Methode und der Serviceeinheit Fluoreszenzmikroskopie, Carl von Ossietzky Universität Oldenburg, für die Nutzung der bildgebenden Einrichtungen. Diese Forschung wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie EXC 2177/1 gefördert.
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -. S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O’Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neurosciences. 407, 8-20 (2019).
