若年成人および高齢スナネズミ蝸牛におけるリボンシナプスの免疫標識および計数
Summary
求心性シナプス構造および有毛細胞を免疫標識し、加齢組織における自己蛍光を消光し、蝸牛の長さを解剖および推定し、共焦点イメージングで得られた画像スタック中のシナプスを定量することによって、若年成人および加齢スナネズミ蝸牛を処理するためのプロトコールが提示される。
Abstract
内有毛細胞と求心性聴覚神経線維をつなぐリボンシナプスの喪失は、加齢性難聴の原因の一つと考えられています。リボンシナプスの喪失を検出する最も一般的な方法は、個々の蝸牛のいくつかの鼻トピック位置からの定量的サンプリングを可能にするため、免疫標識である。しかし、関心のある構造は骨の蝸牛の奥深くに埋もれています。スナネズミは加齢性難聴の動物モデルとして使用されています。ここでは、固定、スナネズミ蝸牛全体マウントの免疫標識、共焦点画像化、およびリボンシナプス数および体積の定量化のための日常的なプロトコールが記載されている。さらに、貴重な高齢の個人から良好な材料を得ることに関連する特定の課題が強調される。
スナネズミは安楽死させられ、心臓血管に灌流されるか、鼓膜水疱が頭蓋骨から慎重に解剖されます。蝸牛は頂点と基部で開き、固定液に直接移されます。最初の方法に関係なく、蝸牛は後固定され、続いて脱灰される。次いで、組織は、シナプス前およびシナプス後構造および有毛細胞に対する一次抗体で標識される。次に、蝸牛を、それぞれの一次抗体に対して特異的な二次蛍光タグ付き抗体と共にインキュベートする。その後、老化したスナネズミの蝸牛を自己蛍光消光剤で処理して、高齢動物の組織の典型的に実質的なバックグラウンド蛍光を減少させる。
最後に、蝸牛を6〜11個のセグメントに解剖する。蝸牛全体の長さは、特定の蝸牛の位置が個人間で確実に決定されるように再構築される。連続して取得される共焦点画像スタックは、選択された位置の有毛細胞およびシナプスを視覚化するのに役立つ。共焦点スタックは畳み取り解除され、シナプスはImageJを使用して手動でカウントされるか、またはシナプス構造のより広範な定量化がMatlabでカスタム記述された画像解析手順で実行されます。
Introduction
加齢性難聴は、65歳以上の世界人口の3分の1以上が罹患する世界で最も普及している疾患の1つです1。根本的な原因はまだ議論中であり、積極的に調査中ですが、内部有毛細胞(IHC)と求心性聴覚神経線維2をつなぐ特殊なシナプスの喪失が含まれる可能性があります。これらのリボンシナプスは、神経伝達物質グルタミン酸で満たされた小胞がそれにつながれたシナプス前構造、ならびにシナプス後α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸(AMPA)グルタミン酸受容体3,4,5を含む。スナネズミでは、〜20個の求心性聴覚神経線維が1つのIHC6、7、8に接触する。モディオラスに面したIHC上の線維は大きなシナプスリボンに対向し、IHCの柱側で接続する線維は小さなシナプスリボンに対向している(すなわち、ネコ9、スナネズミ7、モルモット10、およびマウス3、11、12、13、14)。さらに、スナネズミでは、シナプス前リボンおよびシナプス後グルタミン酸パッチのサイズは正の相関がある7,14。IHCのモディオラー側の大きなリボンに対向する繊維は口径が小さく、自発速度が低く、閾値が高い15。低自発速度繊維は、IHCs15の柱側に位置する高自発的低閾値繊維よりも、騒音曝露10および耳毒性薬物16に対してより脆弱であるという証拠がある。
リボンシナプスの喪失は、蝸牛神経加齢性難聴における最も初期の変性事象であるが、螺旋状神経節細胞およびその求心性聴覚神経線維の喪失は17,18に遅れをとっている。電気生理学的相関は、聴覚脳幹応答17および化合物活動電位8の記録を含み;しかし、これらはシナプス損失の微妙さを反映していない、なぜなら低い自発速度繊維はこれらの尺度に寄与しないからである16。より有望な電気生理学的測定基準は、質量電位誘導神経指数19および刺激周囲時間応答20である。しかしながら、これらは、動物が聴覚神経線維喪失を超えて、残りの聴覚神経線維8の活動に影響を及ぼす他の蝸牛病理を有していない場合にのみ信頼できる。さらに、スナネズミにおける行動学的に評価された閾値は、シナプス数21と相関していなかった。したがって、生存しているリボンシナプスの信頼できる定量化、したがって、機能的な聴覚神経線維の数は、蝸牛組織の直接検査によってのみ可能である。
モンゴルのスナネズミ(Meriones unguiculatus)は、加齢性難聴を研究するのに適した動物モデルです。それは短い寿命を有し、ヒトに似た低周波聴力を有し、維持が容易であり、加齢性難聴に関連するヒト病理との類似性を示す2,22,23,24。スナネズミは、生後36ヶ月に達すると老化したとみなされ、平均寿命の終わり近くになります22。重要なことに、リボンシナプスの加齢に伴う喪失は、静かな環境で飼育され老化したスナネズミで実証されている8,21。
ここでは、若年成人から加齢までの異なる年齢のスナネズミからの蝸牛を免疫標識、解剖、および分析するためのプロトコールが提示される。シナプス前部(CtBP2)、シナプス後グルタミン酸受容体パッチ(GluA2)、およびIHC(myoVIIa)の成分に対する抗体が使用される。老化した蝸牛のバックグラウンドを減少させ、蛍光シグナルをそのまま残す自己蛍光消光剤が適用されます。また、感覚上皮と線条体血管の両方を調べるために蝸牛を解剖する方法について説明する。蝸牛の長さは、特定の最良の周波数25に対応する別個の蝸牛位置の選択を可能にするために測定される。シナプス数の定量化は、自由に入手可能なソフトウェアImageJ26を用いて行われる。個々のHC内のシナプスボリュームと位置の追加定量化は、Matlabで書かれたソフトウェアカスタムで実行されます。このソフトウェアは、著者が専門的なドキュメントとサポートを提供するためのリソースが不足しているため、一般に公開されていません。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコールに概説されている方法を用いると、若年成人および高齢のスナネズミ由来の蝸牛におけるIHCおよびシナプス構造を免疫標識し、シナプス前およびシナプス後要素の共局在化によって推定された機能的シナプスを同定し、それらを個々のIHCに割り当て、それらの数、体積、および位置を定量することができる。このアプローチで用いた抗体はまた、外側有毛細胞(OHC;myoVIIa)およ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Lichun Zhangがイメージング施設の使用のために、この方法とOldenburgのCarl von Ossietzky University of Oldenburgの蛍光顕微鏡サービスユニットの確立を支援したことを認めている。この研究は、ドイツの卓越性戦略-EXC 2177/1の下でドイツ研究財団(DFG、ドイツ研究財団)によって資金提供されました。
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
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