올리고뉴클레오티드 5′-트리포스페이트는 필수 생물학적 경로에서 유비쿼터스 성분이며 생명 공학 응용에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 여기에서, 우리는 표준 자동화 합성 기술에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 출발하여 올리고뉴클레오티드 5′-트리포스페이트의 일상적인 합성 및 정제를 위한 기술을 기술한다.
5′-트리포스페이트는 모든 생애에서 발견되는 필수적인 핵산 변형이며, 생명공학 및 합성 생물학에서 올리고뉴클레오티드의 기능적 변형으로 점점 더 많이 사용되고 있다. 올리고뉴클레오티드 5′-트리포스페이트는 역사적으로 효소적 방법에 의해 시험관내에서 제조되어 왔다. 그러나, 이들 방법은 천연 RNA 올리고뉴클레오티드로 제한되고, 강한 서열 선호도를 가지며, 이종 생성물을 생산하는 경향이 있다. 화학적 트리포스포릴화의 새로운 방법은 포스포르아미다이트 화학에 의한 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성의 비용 절감과 현재 이용 가능한 다양한 뉴클레오티드 변형을 보완한다. 따라서, 임의의 서열 및 길이의 올리고뉴클레오티드 트리포스페이트의 합성, 및 선택적으로 다양한 비천연 변형을 함유하는, 이제 접근이 가능하다.
이 논문은 살리실 포스포로클로리다이트 및 피로포스페이트를 사용하는 올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화를 위한 적절한 방법 및 기술을 제시한다. 이 방법은 상업적으로 이용가능한 시약을 사용하고, 표준 고상 합성 방법에 의해 제조된 대부분의 올리고뉴클레오티드와 상용성이며, 탈보호 및 정제 전에 올리고뉴클레오티드 합성에 이어 2시간 내에 완료될 수 있다. 촉매 RNA 효소를 위한 기질로서 화학적으로 트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드의 두 가지 용도가 입증되며, 비생물학적 L-RNA 트리포스페이트로부터의 해머헤드 리보자임의 미러 이미지 버전의 합성을 포함한다.
RNA의 5′-트리포스포릴화된 형태는 생명의 모든 도메인에서의 RNA 전사와 많은 RNA 바이러스의 수명주기 동안 RNA 복제에 의해 생성되기 때문에 생물학에서 유비쿼터스이다. 이들 트리포스페이트는 진핵생물에서 7-메틸구아닐레이트-캡핑된 mRNA의 형성을 위한 기질로서 작용하며, 따라서, 단백질 발현1에 필수적인 역할을 한다. 대조적으로, 삼인산염은 박테리아와 바이러스에 보유된다; 따라서, RNA 5′-트리포스페이트는 진핵생물 2,3,4,5,6,7에서 선천적 면역 반응 조절자에 의해 인식된다. 생물학 밖에서, RNA 리가아제 리보자임의 숙주는 시험관내8에서 5′-트리포스페이트를 사용하도록 진화되었고, 진단 검정 9,10,11,12,13,14,15에 사용하기 위해 변형되었다. 하나의 그러한 리보자임은 작은 L-RNA 올리고뉴클레오티드 5′-트리포스페이트16,17,18로부터의 천연 D-RNA의 비생물학적 “미러-이미지” 거울상이성질체인 L-RNA의 주형-의존성 합성에 사용될 수 있다. 다양한 서열 및 백본 조성의 트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드의 일상적인 준비는 이들 시스템을 조사하는 데 필수적이다.
실험실에서 RNA 5′-트리포스페이트를 제조하는 가장 일반적이고 접근하기 쉬운 방법은 시험관내 전사에 의한 것이다. 그러나, 이러한 방법에 의해 생산된 RNA는 RNA 중합효소의 프로모터 및 기질 요건에 의해 서열 및 크기가 제한된다. T7 RNA 중합효소 및 특수 유도체는 이러한 목적을 위해 사용되는 가장 일반적인 중합효소(19,20,21,22)이다. 이들 효소로 제조된 시험관내 전사된 RNA는 5′-말단 퓨린으로 시작되어야 하며, 처음 10개 뉴클레오티드23,24에서 퓨린에 강하게 편향된다. 더욱이, 염기 또는 골격-변형된 뉴클레오티드의 효소적 혼입은 기껏해야 비효율적이며 천연 중합효소로는 더 자주 불가능하며, 천연 D-RNA 이외의 것으로 구성된 올리고뉴클레오티드 5′-트리포스페이트를 생산할 기회를 제한한다. 또 다른 제한 인자는 시험관내 전사에 의해 생성된 RNA가 실질적인 5′- 및 3′- 이질성을 함유할 수 있고, 20 nt 23,24,25,26,27보다 짧을 때 매우 이질적인 생성물로서 생성된다는 것이다.
대조적으로, 고상 포스포르아미다이트 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화28,29,30,31,32,33,34,35는 임의의 서열의 3-50 nt 길이의 올리고뉴클레오티드 5′-트리포스페이트를 제조하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 포스포르아미다이트 합성에 접근할 수 있는 방대한 핵산 변형은 5′-트리포스포릴화 14,15,16,17,18,29,36 이전에 올리고뉴클레오티드에 첨가될 수 있다. 이들 방법 중 다수는 모노뉴클레오시드37의 용액상 트리포스포릴화를 위해 Ludwig 및 Eckstein에 의해 개발된 포스피틸화 시약 살리실 포스포로클로리다이트를 사용한다. 이 시약을 사용한 올리고뉴클레오티드의 트리포스포릴화는 올리고뉴클레오티드 5′-히드록실의 포스피틸화, 피로포스페이트와의 반응 및 산화에 의한 트리포스페이트로의 전환, 이어서 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드의 절단, 탈보호 및 정제를 위한 표준 절차에 의해 고체상 상에서 달성된다(도 1)28.
도 1: 합성 올리고뉴클레오티드의 트리포스포릴화를 위한 반응식. 첫 번째 단계에서, 올리고뉴클레오티드 5ʹ-히드록실은 SalPCl로 포스피틸화된다. 다음 단계에서, 5ʹ-살리실 포스파이트는 TBAP와 반응하여 고리형 메타포스파이트를 형성한 다음, 세 번째 단계에서 산화되어 DNA/RNA 합성기 산화 용액(0.1 M 요오드/피리딘/H2O/THF)에서 순환 5ʹ-트리메타포스페이트를 생성하고, 이는 신속하게 가수분해되어 동일한 용액28,33에서 선형 5ʹ-트리포스페이트를 생성하며, 37. 고체 CPG 지지체로부터의 후속 알칼리성 절단 및 수성 MeNH2/암모니아 중의 올리고뉴클레오티드의 탈보호는 임의의 잔류 고리형 트리메타포스페이트를 선형 형태로 가수분해할 것이다. 약어: SalPCl = 살리실 포스포로클로리다이트; TBAP = 트리부틸암모늄 피로포스페이트; THF = 테트라히드로푸란; CPG = 조절된 기공 유리; MeNH2 = 메틸아민. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 방법을 사용하는 초기 발표 된 보고서는 종종 불량한 수율과 바람직하지 않은 부제품 28,37,38로 고통 받았지만 무수 조건을주의 깊게 유지하는 것이 일상적으로 높은 수율을 얻는 데 필요한 모든 것입니다. 이는 시약을 신중하게 준비하고 표준 플라스틱 성분으로 조립 된 간단한 반응 장치를 사용하여 달성 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 시약의 제조, 반응 챔버의 조립, 트리포스포릴화 반응, 및 트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드의 후속 탈보호 및 정제를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화를 위한 적절한 단계를 입증한다. 또한 천연 D-RNA 및 비생물적 L-RNA 골격을 갖는 더 큰 핵산 생성물의 합성을 위한 리가아제 리보자임(ligase ribozymes)을 위한 기질로서 5′-트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드의 대표적인 용도가 포함된다.
여기에 설명된 트리포스포릴화 절차는 표준 포스포르아미다이트 화학을 이용한 올리고뉴클레오티드 합성과 광범위하게 양립가능하다. 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 포스파이트 상의 표준 β-시아노에틸, 및 핵염기의 외환형 아민 상의 이소부티릴, 디메틸포름아미딜, 아세틸, 페녹시아세틸 또는 4-이소프로필페녹시아세틸기를 포함하는 AMA39에서 신속한 탈보호와 양립가능한 염기-불안정한 보호기를 가져야 한다. 리보스 2′-히드록실기는 실릴 보호기, 즉 t-부틸디메틸실릴(TBDMS) 또는 트리이소프로필실릴옥시메틸(TOM)40,41에 의해 보호되어야 한다. 염기-불안정성 피발로일옥시메틸(PivOM) 그룹은 또한 화학적 트리포스포릴화30과 상용성인 것으로 보고되었다.
합성 올리고뉴클레오티드28,29,30,31,32,33,34,35의 화학적 트리인산화에 대해 다수의 방법이 기술되었다. 우리는 Ludwig-Eckstein 시약37을 사용한 트리포스포릴화가 가장 접근하기 쉬운 것 중 하나라는 것을 발견했으며, 시약의 특수 합성과 특수 장비가 필요하지 않습니다. 이 방법에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드 5′-트리포스페이트는 RNA 리보자임(RNABE ribozymes)의 기질로서 일상적으로 사용되어 왔으며, 효소적으로 접근이 불가능한 L-RNA 올리고뉴클레오티드 트리포스페이트를 사용하여 주형-의존적 합성 및 이 “미러-이미지” 핵산의 복제를 달성하는것을 포함하여 14,16,17,18 . 이 방법은 또한 척추동물 6,7에서 선천적 면역 반응의 강력한 활성화제인 작은 5′-트리포스포릴화된 줄기-루프 RNAs의 제조에 적합하다.
Ludwig-Eckstein 시약인 살리실 포스포로클로리다이트37은 물에 매우 반응성이 높으며, 올리고뉴클레오티드 컬럼에 로딩하기 전에 시약을 용해시킬 때 도입된 모든 물을 효과적으로 제거한다. 그러나, 이 시점 이후, 5′-포스피실화된 올리고뉴클레오티드는 피로포스페이트 위에 시스템에 도입된 임의의 물과 우선적으로 반응하여, 워크업 28,37,38 후에 5′-H-포스포네이트 부생성물을 형성할 것이다. 트리인산화 시약 및 트리인산화 반응 챔버를 조심스럽게 준비하면 이러한 부산물이 형성되지 않도록 한다. 용제 건조를 위해, 유형 4 Å 분자체는 대부분의 올리고뉴클레오티드 합성 시약 회사에 의해 다양한 상표명으로 대부분의 유기 용매와 호환되는 테프론 백에 미리 포장되어 판매됩니다. 무수 분위기 하에서 글로브 박스에서 트리포스포릴화를 수행하는 것과 같은 추가적인 예방조치는 일반적으로 필요하지 않다.
TBAP와 5′-포스피실화된 올리고뉴클레오티드의 반응은 고리형 5′-트리메타포스파이트 중간체를 형성하고, 이는 올리고뉴클레오티드 합성 산화제 용액(물/피리딘/THF의 요오드)을 사용하여 고리형 5′-트리메타포스페이트로 산화된다. 상업용 산화제 용액은 다양한 양의 요오드를 사용하며 트리포스페이트에 대한 완전한 산화를 보장하기 위해 높은 0.1M 요오드 농도를 사용하는 것이 필수적이라는 점에 유의해야합니다. 고리형 생성물은 동일한 용액(37)에서 최종 선형 5′-트리포스페이트로 가수분해되고, 물 이외의 친핵체와의 선형화가 필요한 경우 대안적인 무수 산화제 용액을 사용해야 한다(용도는 아래 참조)33. 그러나, 임의의 잔류 고리형 트리메타포스페이트는 올리고뉴클레오티드의 후속 알칼리성 탈보호 동안 선형화될 것이다. 순환 5′-트리메타포스페이트의 가수분해는 분지형 트리포스페이트37,46이 아닌 선형만을 산출한다.
올리고뉴클레오티드 탈보호는 전형적으로 5′-트리포스포릴화를 수용하기 위해 변형될 필요가 없지만, 몇 가지 예방책이 취해져야 한다. 삼인산염은 알칼리성 조건에 대한 짧은 노출로 비교적 안정하지만, 필요한 것보다 더 오래 AMA에 삼인산염을 노출시키지 않도록 주의해야 한다. 65°C에서 10분 이상 암모니아 또는 AMA에서 보다 장기간의 처리를 필요로 하는 보호기는 피해야 한다. 실온에서 암모니아에서 2h와 같은 보다 온화한 처리는 다른 포스포르아미다이트 보호기와 양립할 때 허용가능하다. 실릴-보호된 합성 RNA 올리고뉴클레오티드에 대한 일반적인, 빠른 탈보호 방법은 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 및 고온47을 이용한다; 그러나, RNA 5′-트리포스페이트를 제조할 때는 장기간 산성 조건이 트리포스페이트 가수분해31,32를 가속화하는 것으로 밝혀짐에 따라 이것은 피해야 한다.
제조 PAGE는 5′-트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드의 탈보호 후 정제를 위한 가장 간단하고 가장 신뢰할 수 있는 방법임이 입증되었다(도 3 및 도 4). 그러나, 제조용 역상 HPLC는 또한 트리인산화된 생성물을 정제하는데 사용될 수 있다. 5′-디포스페이트 및 5′-모노포스페이트 생성물의 존재는 질량 분광법에 의한 삼인산화를 검증할 때 일상적으로 관찰된다. 우리는 화학 합성 또는 전사에 의해 제조 된 고순도 물질로부터 질량 분광법 중에 5′-트리 포스페이트 단편화를 관찰했으며, 특히 장비가 올리고 뉴클레오티드 분석에 최적화되지 않은 경우 특히 그렇습니다. 그럼에도 불구하고, RP-LC 분석은 종종 5′-디포스페이트 부산물의 10%-20%가 더 긴 5′-트리포스포릴화 올리고뉴클레오티드에 존재한다는 것을 보여준다(도 4). 트리부틸암모늄 피로포스페이트의 상업적 제제는 20% 모노포스페이트로 오염될 수 있으며, 이는 트리포스포릴화 동안 부생성물로서 5′-디포스페이트를 산출할 것이다30,31. 이 시약을 사내에서 조심스럽게 준비하면 훨씬 더 순수한 TBAP 주식(31)을 얻을 수 있다. 그러나, 우리는 TBAP의 상업적 공급원을 사용하여 트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드가 시험관내 전사에 의해 제조된 물질에 비해 효소 반응에서 기질로서 사용될 때 여전히 필적할만한 또는 더 큰 반응성을 나타낸다는 것을 발견하였다 (도 5B).
루드비히-에크슈타인 시약을 사용한 트리포스포릴화 올리고뉴클레오티드의 한 가지 주목할만한 추가의 사용은 고리형 트리메타포스파이트 중간체33을 이용한다. 후속 산화 단계가 무수 조건 하에서 올리고뉴클레오티드 산화에 자주 사용되는 헥산 중의 1 M t-부틸 퍼옥사이드로 진행되면, 포스파이트의 산화는 고리 개구 가수분해 없이 발생하여, 고리형 트리메타포스페이트를 산출한다. 이 중간체는 이어서 일차 아민 또는 알콜 친핵체와 반응하여 γ-포스페이트에서 변형된 5′-트리포스페이트를 수득할 수 있다. 이러한 변형은 포스포르아미데이트 결합에 의해 연결된 친유성 태그의 첨가를 포함하며, 이는 RP-LC에 의한 신속한 트리포스페이트 특이적 정제를 용이하게 하고, 이어서 트리포스페이트33으로부터 태그의 산성 가수분해를 수반한다. γ-포스페이트 위치에서의 형광 변형은 또한 리보자임-촉매 라이게이션 반응(15,33)을 위한 실시간 형광 리포터로서 사용하기 위해 도입될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski 및 Katrina Tjhung에게 화학 삼인산화 반응에 대한 모범 사례에 대한 유용한 토론과 Gerald Joyce에게 유용한 의견을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 보조금 MCB 2114588에 의해 지원되었습니다.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter | MilliporeSigma | SLMP025SS | Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5) |
0.22 µm PTFE syringe filter | MilliporeSigma | SLLG013SL | Syringe filter for removing CPG resin (Section 5) |
1 mL plastic syringes | ThermoFisher Scientific | 14-823-434 (BD 309659) | Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
1,4-Dioxane, anhydrous | MilliporeSigma | 296309 | Triphosphorylation solvent (sections 2–4) |
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) | MilliporeSigma | 324124 | Triphosphorylation reagent (sections 2–4) |
30 mL glass bottles | MilliporeSigma | 23232 | Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2) |
3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene | Bio-Rad Laboratories | 7328103 | Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | For PAGE (sections 5–7) |
Acetonitrile, anhydrous, 100 mL | Glen Research | 40-4050-50 | Triphosphorylation solvent (sections 2–4) |
Ammonia-neutralizing Trap | ThermoFisher Scientific | ANT100 and ANS121 | For use with Speedvac DNA130 (section 5) |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad Laboratories | 1610700 | For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7) |
Aqueous ammonia, 28% | MilliporeSigma | 338818 | For preparing AMA deprotection reagent (section 5) |
Aqueous methylamine, 40% | TCI America | TCI-M0137 | For preparing AMA deprotection reagent (section 5) |
Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer | PerSeptive Biosystems | Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer | any column-based synthesizer is acceptable (section 1) |
Bead-capture magnet | ThermoFisher Scientific | 12320D | For streptavidin bead capture (section 7) |
Bromophenol blue | Bio-Rad Laboratories | 1610404 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |
Deep vacuum oil pump | ThermoFisher Scientific | VLP200-115 | For use with lyophilizer (section 5) |
Drierite dessicant, 10-20 mesh | MilliporeSigma | 737828 | Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2) |
D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase | prepared in house18 | 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns | Glen Research | 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E | representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
D-RNA TOM-protected phosphoramidites | ChemGenes | ANP-3201, 3202, 3203, 3205 | representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm | Glen Research | 20-0021-01 | Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1) |
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid | MilliporeSigma | E1894 | Ribozyme reaction buffer component (section 6) |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid | MilliporeSigma | EDS | Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7) |
Filters for Expedite synthesis columns | Glen Research | 20-0021-0F | Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1) |
Fluorescent/phosphorescent gel scanner | Cytiva | Amersham Typhoon RGB, 29187193 | For visualizing analytical PAGE (sections 6–7) |
Formamide, deionized | VWR Life Science | 97062 | For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7) |
Gel image quantitation software | Cytiva | ImageQuant TL | For quantifying scanned gel images (section 6) |
Glass desiccator | MilliporeSigma | CLS3121150 | Triphosphorylation solvent storage (section 2) |
L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk | ChemGenes | N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 | L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
L-RNA hammerhead template | prepared in house18 | 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
L-RNA primer | prepared in house18 | 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
L-RNA TOM-protected phosphoramidites | ChemGenes | OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 | L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1) |
Lyophilizer/Freeze Dryer | VirTis | Benchtop K | For concentrating oligonucleotides (section 5) |
Magnesium Chloride Hexahydrate, solid | MilliporeSigma | M2670 | For ribozyme reactions (sections 6–7) |
N,N-Dimethylformamide, anhydrous | MilliporeSigma | 227056 | Triphosphorylation solvent (section 2) |
NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) | ThermoFisher Scientific | 45000150 | Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5) |
Non-coring stainless steel needle, 20 G | ThermoFisher Scientific | 14-815-410 | Needles for piercing rubber septa (sections 2–4) |
Oligonucleotide extinction coefficient calculator | Integrated DNA Technologies | OligoAnalyzer Tool | Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5) |
Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water | ChemGenes | RN-1456 | Triphosphorylation reagent (section 4) |
PAGE plates | Timberrock/CBS | NGP-250-BO and NO | For PAGE (sections 5–7) |
PAGE power supply | Bio-Rad Laboratories | PowerPac HV 1645056 | For PAGE (sections 5–7) |
PAGE spacers and combs (analytical) | Timberrock/CBS | VGS-0725 and VGC-0714 | For PAGE (sections 6–7) |
PAGE spacers and combs (preparative) | Timberrock/CBS | VGS-3025R and VGC-3001 | For PAGE (section 5) |
PAGE stand | Timberrock/CBS | ASG-250 | For PAGE (sections 5–7) |
Parafilm M | ThermoFisher Scientific | 13-374-12 (Bemis PM999) | Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4) |
PCR thermocycler | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch Thermalcycler | For cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) | MilliporeSigma | GE17-0010-01 | Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5) |
Phosphor screens | Cytiva | 28956480 | For visualizing 32P-labeled RNA (section 6) |
Phosphoramidite synthesis reagents | Glen Research | 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 | representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1) |
Polypropylene screw-cap sealable tube | MilliporeSigma | BR780752 | 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5) |
Pyridine, anhydrous | MilliporeSigma | 270970 | Triphosphorylation solvent (section 2) |
Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) | Novatia | n/a | Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5) |
Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white | MilliporeSigma | Z564702 | Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2) |
Self-replicator ribozyme E | prepared in house14 | 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
Self-replicator substrate A | prepared in house14 | 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
Self-replicator substrate B, transcribed | prepared in house14 | 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ | For self-replicator ribozyme reactions (section 6) |
Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves | ChemGenes | DMT-1975 | Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2) |
Sodium Chloride (NaCl), solid | MilliporeSigma | S7653 | Salt for use in various buffers (sections 5–7) |
Sodium Hydroxide (NaOH), solid | MilliporeSigma | S8045 | Salt for use in various buffers (sections 5–7) |
Statistical data-fitting software | GraphPad | Prism | For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6) |
Streptavidin-coated magnetic beads | ThermoFisher Scientific | 65002 | For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7) |
Sucrose | MilliporeSigma | 84097 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |
TBE running buffer, 10x | ThermoFisher Scientific | AAJ62788K3 | For PAGE (sections 5–7) |
Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran | Aldrich | 216143 | For removing 2′-silyl protecting groups (section 5) |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad Laboratories | 1610801 | For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7) |
Tributylamine | MilliporeSigma | 90781 | Triphosphorylation reagent (section 2) |
Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) | MilliporeSigma | P8533 | Triphosphorylation reagent (section 2) |
Tris base | MilliporeSigma | T6666 | Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7) |
TWEEN20 polysorbate detergent | MilliporeSigma | P7949 | Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7) |
Urea | MilliporeSigma | U5378 | For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7) |
UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000, ND2000 | For measuring oligonucleotide concentrations (section 5) |
Vacuum centrifuge | ThermoFisher Scientific | Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator | For removing AMA and THF (section 5) |
Xylene cyanol | Bio-Rad Laboratories | 1610423 | For PAGE urea loading buffer (section 5) |