Nylige fremskridt inden for humane inducerede pluripotente stamcelledifferentieringsprotokoller giver mulighed for trinvis afledning af organspecifikke celletyper. Her giver vi detaljerede trin til vedligeholdelse og udvidelse af iPSC-afledte luftvejsbasalceller og deres differentiering til et mucociliært epitel i luft-væske-grænsefladekulturer.
Sygdomme i de ledende luftveje såsom astma, cystisk fibrose (CF), primær ciliær dyskinesi (PCD) og virale luftvejsinfektioner er hovedårsager til sygelighed og dødelighed over hele verden. In vitro-platforme , der bruger humane bronchiale epitelceller (HBEC’er), har været medvirkende til vores forståelse af luftvejsepitelet i sundhed og sygdom. Adgang til HBEC’er fra personer med sjældne genetiske sygdomme eller sjældne mutationer er en flaskehals i lungeforskningen.
Inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) genereres let ved at “omprogrammere” somatiske celler og bevarer den enkelte donors unikke genetiske baggrund. Nylige fremskridt giver mulighed for rettet differentiering af iPSC’er til lungeepitelprogenitorceller, alveolære type 2-celler samt cellerne i det ledende luftvejsepitel via basalceller, de vigtigste luftvejsstamceller.
Her skitserer vi en protokol til vedligeholdelse og udvidelse af iPSC-afledte luftvejsbasalceller (herefter iBC’er) samt deres trilineagedifferentiering i luft-væske-grænseflade (ALI) kulturer. iBC’er opretholdes og udvides som epitelkugler suspenderet i dråber af ekstracellulær matrix dyrket i et primært basalcellemedium suppleret med hæmmere af TGF-ß- og BMP-signalveje. iBC’er inden for disse epitelsfærer udtrykker vigtige basale markører TP63 og NGFR, kan renses ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), og når de er belagt på porøse membraner under standard ALI-kulturbetingelser, differentieres til et funktionelt luftvejsepitelatel. ALI-kulturer afledt af raske donorer består af basale, sekretoriske og multicilierede celler og demonstrerer epitelbarriereintegritet, bevægelige cilier og slimsekretion. Kulturer afledt af individer med CF eller PCD rekapitulerer den dysfunktionelle CFTR-medierede chloridtransport eller immotile cilia, de respektive sygdomsfremkaldende epiteldefekter.
Her præsenterer vi en protokol til generering af humane celler, der kan anvendes til modellering og forståelse af luftvejssygdomme.
Kroniske lungesygdomme tegner sig for en stor byrde af sygelighed og dødelighed på verdensplan1. Tilstande, der påvirker de ledende luftveje, såsom astma, cystisk fibrose (CF), primær ciliær dyskinesi (PCD) og virusinfektioner repræsenterer både almindelige og sjældnere sygdomme, erhvervet og genetisk, der bidrager til denne verdensomspændende byrde. De ledende luftvejes vigtigste funktioner er at: 1) fungere som en kanal for den laminære luftstrøm og 2) give mucociliær clearance af patogener og snavs. Sekretoriske, multicilierede og basale celler repræsenterer de vigtigste epitelcelletyper i den ledende luftvej. Sjældnere epitelcelletyper omfatter ionocytter, tuftceller og neuroendokrine celler og er blevet gennemgået andetsteds2.
Generelt har en stor barriere for at forstå sygdomsmekanismer og fremme terapeutiske tilgange været en konsekvent mangel på humant primært væv til brug i prækliniske modeller. HBEC’er betragtes generelt som guldstandard in vitro-modellen for human luftvejsepitelbiologi og har spillet nøgleroller i CF-forskning, især3. Imidlertid isoleres de typisk enten fra bronkoskopiske biopsier, fra lungevæv efter operationen eller fra lunger, der afvises til transplantationsformål. Adgang til HCFC’er fra personer med genetiske sygdomme, herunder forskningsprioriteterne for CF og PCD, er sjælden og uforudsigelig. Overvinde denne flaskehals for patientafledte luftvejsepitelceller er nødvendig. iPSC’er genereres let fra ethvert individ, de bevarer donorens unikke genetiske baggrund og har en bemærkelsesværdig evne til at sprede sig og overleve på lang sigt under cellekulturforhold 4,5,6. Ved at rekapitulere vigtige embryologiske trin gennemgår iPSC’er “rettet differentiering” i organspecifikke celletyper. Vi og andre har udviklet protokoller til at generere iPSC-afledte lungeforfædre, alveolære type 2-celler 7,8 og cellerne i den ledende luftvej inklusive luftvejsbasalceller 9,10,11,12.
Luftvejsbasalcellen er stamcellen i den ledende luftvej13. I tidligere offentliggjort arbejde har vores gruppe genereret iPSC-afledte luftvejsepitelceller, herunder en delmængde (iBC’er), der udtrykker kanoniske basalcellemarkører, herunder TP63, KRT5 og NGFR. Efter signaler fra voksen basalcellebiologi fører hæmning af dobbelte SMAD-veje (TGF-β og BMP) til opregulering af NGFR + iBC’er11,14. NGFR + iBC’er resuspenderes som enkeltceller i dråber af ekstracellulær matrix og dyrkes i et basalcellemedium. De fornyer sig selv for at opretholde en iBC-population og danner epitel-sfæroider; imidlertid differentierer en andel sig også i sekretoriske celler i dette format (kaldet 3D-kultur). I den følgende protokol beskriver vi trinene til at opretholde og udvide disse iBC’er i 3D-kultur samt de trin, der kræves for at generere en funktionel 2-D mucociliær ALI-kultur.
De indledende trin i denne differentieringsprotokol er tidligere blevet offentliggjort og vil ikke blive gennemgået her11,12. Dette manuskript vil centrere sig om udvidelse og rensning af iBC’er og deres efterfølgende differentiering i funktionelle sekretoriske og multicilierede celler i ALI-kultur.
HBEC’er er guldstandardcelletypen til undersøgelse af sygdomme i luftvejsepitelet. På grund af deres begrænsninger (herunder tilgængelighed og vanskeligheder med at genmanipulere) har vi genereret en protokol til afledning af iBC’er og ALI-kulturer. Disse celler kan stamme fra enhver donor og bevare deres unikke genetiske baggrund, hvilket giver mulighed for grundlæggende udviklingsundersøgelser, sygdomsmodellering og ny terapeutisk udvikling.
Mens hvert enkelt trin i den beskrevne protokol er nødvendigt, er der flere, der fortjener ekstra omtale. For det første er det ved hvert trin, der kræver dissociation af sfæroider i enkeltceller, afgørende at undgå overdreven pipettering; enzymatisk fordøjelse (med dispase eller trypsin) fremmer bedre celleoverlevelse, mens overdreven pipettering fører til betydelig celledød. For det andet er det afgørende at udnytte isotypekontrollen ved rensning af NGFR+ iBC’er, og vi anbefaler at vælge de højest udtrykkende NGFR+-celler med FACS (figur 3). Denne tilgang resulterer i optimale ALI-kulturer med passende mucociliær differentiering. Endelig er fremstilling og såning af porøse membraner nøjagtigt som dokumenteret i protokollen grundlæggende for ALI-kulturens overlevelse. Mens vi typisk såer 30.000-60.000 celler pr. indsats, har vi haft succes med så få som 20.000 celler. Mens vellykkede kulturer kan genereres ved hjælp af den humane embryonale stamcellekvalificerede matrixbelægning, har vi for nylig brugt human rekombinant laminin-521 med en signifikant højere holdbarhed af ALI-kulturerne.
Meget sjældent kan iPSC-differentieringer undlade at regulere en passende procentdel af NGFR+ iBC’er. I dette tilfælde kan seriel passaging af iBC’er (i 3D-kultur) resultere i en øget NGFR-frekvens over tid. Begrænsninger i denne protokol inkluderer den tid, omkostninger og ekspertise, der er nødvendig for at generere disse celler. Derudover anerkender vi, at mange forskere er interesserede i de mindre almindelige celletyper af luftvejsepitelet (fx ionocytter, neuroendokrine celler). Mens vi har opdaget nogle af disse sjældnere celletyper, som i primære HBEC-kulturer, identificeres de ikke reproducerbart, sandsynligvis på grund af ufuldstændig viden om de udviklingssignaler, der kræves for at generere disse celler.
Som det er skrevet, begynder ovenstående protokol med optøning af allerede kryopreserverede iBC’er. Detaljerne forud for denne kryopræservering er tidligere beskrevet og uden for dette manuskripts anvendelsesområde11,12.
Vores luftvejsepitel ALI-dyrkningsmetode giver mulighed for generering af funktionelle luftvejsepitelceller fra næsten enhver donor. Dette øger i høj grad tilgængeligheden til dyrebare genetisk kontrollerede luftvejsepitelceller, der kan bruges til sygdomsmodellering, lægemiddelscreening, fremtidige cellebaserede terapier samt for at forbedre forståelsen af udviklingsmønstret i luftvejsepitelet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmerne af laboratorierne Hawkins, Kotton og Davis for deres nyttige input gennem årene vedrørende dette og andre projekter. Vi står også i gæld til Brian Tilton (BU Cell Sorting Director) for hans dedikation og tekniske ekspertise, og vi er taknemmelige for Greg Miller og Marianne James fra Boston University Center for Regenerative Medicine (CReM) for deres support og tekniske ekspertise inden for vedligeholdelse og karakterisering af patientspecifikke iPSC’er, understøttet af NIH-tilskud NO1 75N92020C00005 og U01TR001810. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 og R01HL095993 til D.N.K, R01HL139876 til B.R.D, R01 HL139799 til F.H., og Cystisk Fibrose Foundation (CFF) tilskud CFF 00987G220 og CFF WANG20GO til D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 til B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 til S.S. og CFF HAWKIN20XX2 til F.H.
12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 |