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Article de méthode

Cultiver et manipuler génétiquement des nématodes entomopathogènes

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DOI :

10.3791/63885

⸱

31 mars 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

Dans cet article

Résumé

Les nématodes entomopathogènes vivent en symbiose avec les bactéries et, ensemble, ils infectent avec succès les insectes en sapant leur système immunitaire inné. Pour promouvoir la recherche sur la base génétique de l’infection par les nématodes, des méthodes de maintien et de manipulation génétique des nématodes entomopathogènes sont décrites.

Résumé

Les nématodes entomopathogènes des genres Heterorhabditis et Steinernema sont des parasites obligatoires des insectes qui vivent dans le sol. La principale caractéristique de leur cycle de vie est l’association mutualiste avec les bactéries Photorhabdus et Xenorhabdus, respectivement. Les parasites nématodes sont capables de localiser et d’entrer dans des hôtes d’insectes appropriés, de subvertir la réponse immunitaire des insectes et de se multiplier efficacement pour produire la prochaine génération qui chassera activement de nouvelles proies d’insectes à infecter. En raison des propriétés de leur cycle de vie, les nématodes entomopathogènes sont des agents de lutte biologique populaires, qui sont utilisés en combinaison avec des insecticides pour lutter contre les insectes nuisibles agricoles destructeurs. Simultanément, ces nématodes parasites représentent un outil de recherche pour analyser la pathogénicité des nématodes et les réponses anti-nématodes de l’hôte. Cette recherche est facilitée par le développement récent de techniques génétiques et d’approches transcriptomiques pour comprendre le rôle des molécules sécrétées par les nématodes au cours de l’infection. Ici, un protocole détaillé sur le maintien des nématodes entomopathogènes et l’utilisation d’une procédure d’élimination des gènes est fourni. Ces méthodologies favorisent davantage la caractérisation fonctionnelle des facteurs d’infection par les nématodes entomopathogènes.

Introduction

La recherche sur les nématodes entomopathogènes (EPN) s’est intensifiée au cours des dernières années en raison principalement de l’utilité de ces parasites dans les stratégies de lutte intégrée contre les ravageurs et de leur implication dans la recherche biomédicale fondamentale 1,2. Des études récentes ont établi l’EPN comme organisme modèle dans lequel examiner les composants génétiques des nématodes qui sont activés au cours des différentes étapes du processus d’infection. Ces informations fournissent des indices critiques sur la nature et le nombre de molécules sécrétées par les parasites pour modifier la physiologie de l’hôte et déstabiliser la réponse immunitaire innée des insectes 3,4. Simultanément, ces connaissances sont généralement complétées par de nouveaux détails sur le type de voies de signalisation immunitaire de l’insecte hôte et les fonctions qu’elles régulent pour restreindre l’entrée et la propagation des agents pathogènes 5,6. Comprendre ces processus est crucial pour envisager les deux côtés de l’interaction dynamique entre l’EPN et leurs hôtes insectes. Une meilleure appréciation de la relation EPN-insecte hôte facilitera sans aucun doute des études similaires avec des nématodes parasites de mammifères, ce qui peut conduire à l’identification et à la caractérisation des facteurs d’infection qui interfèrent avec le système immunitaire humain.

Les nématodes EPN Heterorhabditis sp. et Steinernema sp. peuvent infecter un large éventail d’insectes, et leur biologie a été intensément étudiée précédemment. Les deux parasites nématodes diffèrent dans leur mode de reproduction, Heterorhabditis étant autofertilisé et Steinernema subissant une reproduction amphimique, bien que récemment S. hermaphroditum se reproduise par auto-fécondation d’hermaphrodites ou par parthénogenèse 7,8,9. Une autre différence entre les nématodes Heterorhabditis et Steinernema est leur mutualisme symbiotique avec deux genres distincts de bactéries à Gram négatif, Photorhabdus et Xenorhabdus, respectivement, qui sont tous deux de puissants agents pathogènes des insectes. Ces bactéries se trouvent au stade juvénile infectieux (IJ) vivant librement et non nourrissant de l’EPN, qui détectent les hôtes sensibles, accèdent à l’hémocèle d’insecte où ils libèrent leurs bactéries associées qui se répliquent rapidement et colonisent les tissus des insectes. L’EPN et leurs bactéries produisent des facteurs de virulence qui désarment les défenses des insectes et nuisent à l’homéostasie. Après la mort des insectes, les SI nématodes se développent pour devenir des EPN adultes et compléter leur cycle de vie. Une nouvelle cohorte d’IJ formée en réponse à la privation de nourriture et à la surpopulation dans le cadavre d’insectes émerge finalement dans le sol pour chasser les hôtes appropriés 9,10,11,12.

Ici, un protocole efficace pour maintenir, amplifier et manipuler génétiquement les nématodes EPN est décrit. En particulier, le protocole décrit la réplication des IJ symbiotiques de H. bacteriophora et de S. carpocapsae , la génération de nématodes inématiques, la production d’hermaphrodites de H. bacteriophora pour la microinjection, la préparation de l’ARNds et la technique de microinjection. Ces méthodes sont essentielles pour comprendre la base moléculaire de la pathogénicité des nématodes et l’immunité anti-nématodes de l’hôte.

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Protocole

1. Production de juvéniles infectieux de nématodes symbiotiques

  1. Couvrir une boîte de Pétri (10 cm) avec un morceau de papier filtre et ajouter environ 10 à 15 larves de Galleria mellonella (Figure 1A).
  2. À l’aide d’une pipette, distribuer 2 mL d’eau contenant environ 25 à 50 UI par suspension de 10 μL sur les vers de cire. Conservez la boîte de Petri dans une armoire à température ambiante.
  3. Selon l’humidité du papier filtre, ajoutez 1 à 2 mL d’eau tous les 2 jours. Les vers de cire infectés par des IJ meurent normalement dans les 48 heures.
  4. Préparez les pièges à eau de White environ 10 jours après que les vers de cire ont été infectés par lesIJs 8 (Figure 1B,C). Transférez soigneusement les insectes morts sur la partie non trempée du papier filtre. Utilisez de l’eau du robinet pour remplir la boîte de Petri inférieure et placez un bouchon d’un tube de 15 mL comme espaceur pour la ventilation.
  5. Transférez soigneusement les vers de cire mous et fragiles en les soulevant lentement du papier filtre à l’aide d’une pince en plastique. Utilisez de l’eau du robinet au lieu de l’eau déminéralisée ou désionisée. Ces derniers provoquent l’agrégation des nématodes.
    1. Assurez-vous que le niveau d’eau dans le piège à eau atteint environ la moitié de la hauteur de la boîte de Pétri. Attendez-vous à ce que le niveau d’eau change avec le temps en fonction des conditions de température et d’humidité dans la pièce.
  6. Lorsque l’eau de la petite boîte de Pétri devient trouble en raison de la présence de nématodes, utilisez une pipette pour déplacer la nouvelle génération d’IJ dans une fiole de culture cellulaire T25 ou T75.
  7. Ajouter l’eau du robinet jusqu’à environ 40 % du volume jusqu’à ce que la densité appropriée soit atteinte (Figure 1C). Évitez la congestion des nématodes et stockez les flacons de culture cellulaire horizontalement.
  8. Ajouter plus d’eau au fond de la boîte de Petri et répéter les étapes 1.6 et 1.7 jusqu’à ce que les IJ cessent de sortir des carcasses d’insectes dans environ 3-5 jours.

2. Production de juvéniles infectieux de nématodes axeniques

REMARQUE: Les nématodes axeniques sont utilisés parce qu’après la dissociation du complexe nématode-bactérie à l’intérieur de l’insecte, chaque partenaire mutualiste provoque une réponse immunitaire distincte de l’hôte5. La souche mutante Ret16 de Photorhabdus temperata est utilisée parce que ces bactéries soutiennent la croissance de H. bacteriophora mais ne parviennent pas à coloniser l’intestin du nématode13,14.

  1. Heterorhabditis bacteriophora juvéniles infectieux
    1. À l’aide d’une pointe de pipette stérile ou d’une spatule, gratter plusieurs flocons d’une culture congelée de P. temperata Ret16 sur une plaque MacConkey et les stries pour des colonies individuelles. Incuber la plaque pendant 2-3 jours à 28 °C.
    2. Inoculer 10 mL de bouillon LB avec une colonie dans un tube de 50 mL et incuber la culture pendant la nuit à 28 °C dans un incubateur à agitation. Utilisez uniquement les colonies de phase primaire qui sont rouges sur la gélose MacConkey. Les colonies de la phase secondaire seront blanc cassé sur la gélose MacConkey.
    3. Laver 100 μL de culture pendant la nuit avec 900 μL de 1x PBS par centrifugation dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL à 17 900 x g. Décantez le surnageant. Diluer la culture 10x dans 1x PBS. Laissez le tube sur la glace.
    4. Immergez les vers de cire dans une solution d’éthanol à 70%, séchez les insectes avec une serviette en papier et placez-les dans un tube de 50 ml.
    5. Placez le tube sur de la glace pendant 20 minutes pour immobiliser les vers de cire.
    6. Utilisez un papier filtre pour couvrir les moitiés supérieure et inférieure d’une boîte de Pétri (10 cm). Utilisez le couvercle de la boîte de Petri recouvert de papier filtre comme support de base pour l’injection. Humidifiez le papier filtre de la boîte de Petri inférieure et transférez-le sur de la glace pour aider les vers de cire injectés à récupérer.
    7. Pipette 50 μL de bactéries glacées sur un morceau de parafilm et préparer la seringue à aiguille de 22 G. Appuyez doucement sur le piston pour retirer l’air à l’extrémité de l’aiguille.
    8. Gardez un ver de cire près de l’extrémité postérieure sous le stéréoscope (Figure 2).
    9. Injecter 50 μL de la culture bactérienne dans la face dorsale du thorax, de préférence à la jonction entre deux segments. Pour minimiser les dommages internes, injectez juste en dessous de la cuticule, aussi parallèlement que possible au ver de cire. Il est naturel qu’une gouttelette d’hémolymphe saigne lorsque le ver de cire est percé
    10. Transférer les insectes injectés dans la boîte de Petri de récupération.
    11. Répétez les étapes 2.1.7 à 2.1.9 jusqu’à ce que tous les insectes soient injectés avec la bactérie. Pour anesthésier les insectes, placez-les sur de la glace pendant 5 min.
    12. Placez la boîte de Petri dans l’obscurité (p. ex., tiroir ou armoire) et ajoutez de l’eau du robinet au papier filtre s’il semble sec. Les vers de cire succomberont 2 jours après l’injection et apparaîtront rouge brique après environ 3-4 jours. Si les insectes apparaissent bruns, l’infection bactérienne a échoué.
    13. 7 jours après l’infection, transférez les insectes de la couleur rouge brique caractéristique sur une boîte de Petri fraîche recouverte de papier filtre et poursuivez avec « Production de juvéniles infectieux de nématodes symbiotiques » à partir de l’étape 1. Si vous utilisez des nématodes symbiotiques, répétez la procédure de l’étape 2.1. en utilisant les IJ nouvellement produits du premier tour.
    14. H. bacteriophora IJs stérilisant en surface
      1. Recueillir suffisamment de H. bacteriophora symbiotiques et de J axeniques candidats par centrifugation pour fabriquer une pastille de 100 μL dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
      2. Ajouter 500 μL d’eau de Javel à 5 % à la pastille dans chaque tube de microcentrifugation et inverser. Incuber pendant 10 min. Centrifuger à 17 900 x g pendant 1 min. Retirez le surnageant.
      3. Laver la pastille avec 1 mL d’eau stérile et répéter la centrifugation. Retirez le surnageant. Répétez cette étape quatre fois de plus.
    15. Vérification de l’axenicité
      1. Pipette 400 μL d’eau stérile aux nématodes symbiotiques et candidats-axeniques H. bacteriophora .
      2. Placez les nématodes sur les insectes dans la boîte de Pétri et étiquetez les traitements en conséquence.
      3. Placez les boîtes de Petri avec les insectes infectés dans l’obscurité et vérifiez périodiquement si les vers de cire deviennent rouges.
        REMARQUE: Les vers de cire infectés par des nématodes symbiotiques de H. bacteriophora deviendront rouges dans les 2 jours suivant l’infection. La décoloration du ver de cire est due à la sécrétion de divers composés produits par les bactéries photorhabdus mutualistes au cours du processus d’infection. L’absence de couleur rouge chez les vers de cire infectés 4 jours après l’infection confirme que les H. bacteriophora sont axeniques. En effet, la bactérie P. temperata Ret16 n’est pas présente dans l’intestin du nématode.
    16. Autre méthode de vérification de l’axenicité
      1. Stériliser en surface les IJ symbiotiques de H. bacteriophora et les IJ H. bacteriophora axesniques candidats, comme décrit à l’étape 2.1.14.
      2. Homogénéiser environ 500 UI dans 500 μL de PBS stérile 1x dans des tubes de microfuge à l’aide de pilons stériles. Faites tourner l’homogénat, décantez le surnageant et étalez-le sur la gélose LB. Incuber les plaques à 28 °C pendant 24 h.
      3. Comptez les unités formant la colonie (UFC) pour chaque plaque. Les échantillons de H. bacteriophora axenic ne formeront aucune colonie de la bactérie symbiotique P. luminescens .
  2. Steinernema carpocapsae Juvéniles infectieux
    1. Préparation de plaques de gélose lipidique (la solution de 300 mL fait environ 20 plaques fendues)
      1. Peser 2,4 g de bouillon nutritif, 4,5 g d’extrait de levure et 1,5 g de gélose et les ajouter à 267 ml d’eau désionisée. Autoclavez la solution.
      2. Ajouter 3 mL de 1 MMgCl2, 1,2 mL d’huile de maïs et 28,8 mL de sirop de maïs à 7 %.
      3. Préparer et ajouter à la solution 300 μL de 30 mg/mL de kanamycine et 300 μL d’ampicilline de 50 mg/mL (stérilisés avec un filtre de 0,2 μm).
      4. Décanter le mélange sur la moitié d’une boîte de Petri divisée / plaque fendue.
    2. Préparation de X. nematophila (souche ΔrpoS) pelouse bactérienne
      1. Culture de X. nematophila (Xn) ΔrpoS directement à partir d’un stock bactérien congelé dans 2 mL de solution LB/kan/amp sur un agitateur à 30 °C pendant la nuit.
      2. Inoculer 5 mL de milieu LB contenant 30 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL d’ampicilline avec 250 μL de la culture pendant la nuit et faire croître les bactéries pendant la nuit sur un agitateur.
        REMARQUE: Les bactéries Xn ne se développent pas bien lorsqu’elles sont striées directement sur les milieux lipidiques de sélection d’un bouillon congelé. Si nécessaire, les phases primaire et secondaire Xn peuvent d’abord être confirmées sur des milieux NBTA (gélose nutritive complétée par 25 mg de bleu de bromothymol l−1 et 40 mg de chlorure de triphényltétrazolium l−1) avant de commencer une culture liquide fraîche.
      3. Pipette 100 μL de la culture sur les plaques de gélose lipidique et étaler sur toute la plaque avec une boucle d’inoculation stérile. Incuber les plaques pendant 24 h à 30 °C.
    3. S. carpocapsae IJs stérilisant la surface
      1. Laissez une fiole contenant des IJs à un angle tel que les IJ s’enfoncent dans un coin de la fiole. Aspirer 1 mL des IJ décantés dans un tube de microcentrifugation. Centrifuger à 17 900 x g pendant 10 s. Retirez le surnageant.
      2. Ajouter 1 mL de solution d’eau de Javel fraîchement préparée à 1 %. Inverser les tubes pour bien mélanger. Incuber pendant 1 min (une incubation prolongée d’eau de Javel entraînera la mort de l’IJ). Tourner à nouveau pendant 10 s. Retirez le surnageant.
      3. Pour éliminer les résidus d’eau de Javel, lavez les nématodes avec 1 mL d’eau distillée stérile et centrifugez pendant 10 s. Retirez le surnageant. Répétez le lavage quatre fois de plus.
      4. Estimer le nombre d’IJ par mL en comptant 10 à 20 μL des IJ lavés sous le stéréoscope et ajuster la concentration des IJ en conséquence.
    4. Élevage de S. carpocapsae IJs
      1. Transférer avec une pipette environ 1000 UI sur les plaques fendues de gélose lipidique (Figure 3, image de gauche). Placez les plaques dans une armoire ou un tiroir humidifié. Utilisez des serviettes en papier humides pour augmenter l’humidité. Maintenir les plaques à température ambiante (22-25 °C).
      2. Vérifiez les serviettes en papier tous les deux jours pour vous assurer qu’elles restent humides. Si nécessaire, ajoutez de l’eau tous les deux jours aux serviettes en papier pour maintenir l’humidité dans l’armoire ou le tiroir. Alternativement, placez un bain-marie au fond de l’armoire pour augmenter l’humidité.
      3. Lorsque les IJ apparaissent uniquement, ajoutez de l’eau de l’autre côté de la plaque et placez une couche de papier filtre au milieu de la plaque (piège à eau, figure 3, image de droite). Recueillir cette eau contenant les IJs de la première ronde dans une fiole de culture cellulaire T75. Ce sont les nématodes Round I S. carpocapsae .
      4. Stériliser à nouveau en surface avec de l’eau de Javel (étape 2.2.3) et répéter le processus de l’étape 2.2 en utilisant les nématodes Carpocapsae Round 1 S. Le résultat sera round 2 S. carpocapsae nématodes.
      5. Vérifiez sous un stéréoscope tous les quelques jours pour suivre le développement des nématodes.
    5. Vérification de l’état axenique de S. carpocapsae IJs
      1. Stérilisez en surface les IJs round 1, round 2 et symbiotiques de S. carpocapsae avec de l’eau de Javel comme décrit à l’étape 2.2.3.
      2. Homogénéiser environ 400 à 700 UI dans des tubes de microfuge à l’aide de pilons en plastique stériles. Centrifuger l’homogénat, décanter le surnageant et étaler la solution sur des plaques de gélose LB. Conserver les plaques de gélose dans un incubateur réglé à 28 °C pendant 24 h.
      3. Comptez la formation d’UFC pour chaque plaque. Les échantillons de nématodes axeniques ne produiront aucune croissance bactérienne.
    6. Vérification de l’état axenique de S. carpocapsae IJs par PCR
      1. Stérilisez en surface les IJs round 1, round 2 et symbiotiques de S. carpocapsae avec de l’eau de Javel comme décrit à l’étape 2.2.3.
      2. Extraire l’ADN de l’homogénat. Une procédure d’extraction détaillée est décrite à la section 4.1.2 ci-dessous.
      3. Effectuer la PCR à l’aide des amorces XptA2 avec une température de recuit de 61 °C :
        XptA F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
        XptA R: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
        REMARQUE: Ces amorces amplifient le gène insecticide XptA2 de X. nematophila, produisant un amplicon de taille 231 bp. Le programme de cyclisme était le suivant : 95 °C pendant 2 min, 34 cycles de 95 °C pendant 30 s, température de recuit de 61 °C pendant 1 min et 73 °C pendant 1 min suivi de 72 °C pendant 10 min.
      4. Visualisez les fragments amplifiés par séparation dans un gel d’agarose à 1,5%. Les échantillons stérilisés en surface axenique ne formeront aucune bande.

3. Élevage de H. bacteriophora hermaphrodites pour la microinjection

  1. Préparez des assiettes de boîte de Petri de 6 cm avec DU NA+chol (1,5x bouillon nutritif, 1,5 % de gélose et 10 μg/mL de cholestérol).
  2. Préparer 3 mL de solution de PP3 (2% de protéase peptone #3, PP3) dans un tube de culture de 10 mL.
  3. Utilisez une pointe stérile de 20 μL pour gratter le haut du stock de glycérol P. luminescens (glycérol stérile à 25 % vol/vol) maintenu à -80 °C et déposez-le dans le tube de culture.
  4. Incuber le tube pendant la nuit dans un agitateur à température contrôlée réglé à 28 °C, 200 tr/min.
  5. Le lendemain, la culture sera de couleur rouge clair. Plaquer 50 μL de la culture sur une boîte de Petri NA+chol de 6 cm et l’étaler à l’aide d’un épandeur bactérien de manière circulaire.
  6. Placez les plaques dans un incubateur à 28 °C. La pelouse P. luminescens sera prête en 24-36 h et apparaîtra de couleur rouge clair.
  7. Inoculez la plaque avec 50 à 100 IJ stérilisés en surface et maintenez la plaque à 28 °C.
  8. L4 hermaphrodite en bonne santé commencera à apparaître environ 48 à 54 heures après l’inoculation. L4 H. bacteriophora hermaphrodites tardifs en bonne santé et non affamés est nécessaire pour l’injection.

4. Préparation de l’ARNds

  1. Conception de l’apprêt
    1. Concevoir des amorces pour que l’ARNd cible environ 500 régions d’exons de paires de bases de l’ADN de H. bactériophora .
      1. Les amorces pour les régions d’intérêt peuvent être déterminées à l’aide de Primer3 (https://primer3.ut.ee) ou d’un programme similaire, en sélectionnant une longueur de produit optimale de 500 paires de bases, Tm de 60 °C et une longueur d’amorce de 22 nucléotides.
      2. Ajouter un site T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) aux extrémités 5′ de chaque amorce avant pour permettre la transcription in vitro.
  2. Isolement génomique de l’ADN
    1. Utiliser de l’ADN génomique isolé à partir de pastilles congelées d’environ 50 000 IJ H. bacteriophora pour la synthèse de l’ARNd.
    2. Utiliser une pastille IJ remise en suspension dans 50 μL de tampon de lyse (50 mM KCl, 0,05 % (p/v) de gélatine, 10 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,45 % Tween 20, 60 μg/mL Protéinase K, 2,5 mM MgCl2) placée à −80 °C pendant au moins 30 min.
    3. Homogénéiser la pastille avec un petit pilon tubulaire.
    4. Réchauffer la solution à température ambiante et incuber à 60 °C pendant 2 h, en vortex toutes les 15 minutes.
    5. Dénaturer la protéinase K en incubant le tissu homogénéisé pendant 15 min à 95 °C.
    6. Refroidir l’échantillon à 4 °C et centrifuger à 3 400 x g pendant 1 min.
    7. Utilisez le surnageant résultant comme modèle pour la PCR ultérieure.
    8. Configurez une réaction pcR de 50 μL à l’aide d’un mélange maître commercial avec 200 ng d’ADN modèle, 0,2 μM d’amorce avant et arrière et les conditions de cycle suggérées par le fabricant.
    9. Analyser la réaction pcr sur un gel d’agarose à 1,2% pour vérifier que les réactions ont produit des bandes uniques de la taille prévue.
  3. Synthèse d’ARNd
    1. Utilisez un kit de transcription commerciale.
    2. Utilisez une réaction PCR de 5 μL pour la transcription in vitro. Suivez les instructions du fabricant.
    3. Incuber la réaction pendant 16 h à 37 °C.
    4. Nettoyez les réactions de transcription in vitro avec un kit commercial utilisant la précipitation d’acétate d’ammonium / éthanol pour concentrer l’ARNds.
    5. Suspendre l’ARNds granulé dans 10 μL d’eau sans RNase.
    6. Quantifiez l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre.
    7. Évaluer la qualité en séparant l’ARNds sur un gel d’agarose à 1,2 %

5. Microinjection

REMARQUE: Un tampon d’injection est un couvercle en verre avec une couche de 2% (w / v) d’agarose au centre. Lorsque les vers à injecter sont transférés dans ces coussinets, la couche d’agarose les immobilise pour la procédure. Normalement, des tampons supplémentaires sont conservés près du microscope pour un usage général.

  1. Préparation du tampon d’injection
    1. Faire bouillir 2 % d’agarose dans l’eau en ajoutant 0,2 g d’agarose à 10 mL d’eau.
    2. Placez 1 à 4 gouttes (~50 μL) sur le centre d’un couvercle en verre de 50 mm x 70 mm d’épaisseur.
    3. Utilisez un autre couvercle pour aplatir la goutte.
    4. Laissez sécher le couvercle pendant 2-3 minutes avant de faire glisser le couvercle sur le côté.
    5. Marquez d’un « R » le côté droit du couvercle orienté vers le haut.
    6. Laissez les lames sécher à température ambiante pendant 1 jour avant de les utiliser.
  2. Préparation des aiguilles d’injection
    1. Utilisez des capillaires en verre de 1,0 mm contenant un filament fin interne. Cela permet un remplissage efficace de l’aiguille.
      REMARQUE: Tout extracteur d’aiguilles commercial (par exemple, Narishige PB-7) peut être utilisé.
    2. Allumez le tire-aiguille.
    3. Assurez-vous que l’appareil de chauffage est réglé au maximum et que le solénoïde est réglé sur 8,40 pour assurer la netteté de l’aiguille requise et la longueur appropriée.
    4. Insérez le tube capillaire dans la crête supérieure du bouton à travers le filament et serrez le bouton supérieur. Le haut du tube capillaire sera au niveau du haut de l’arracheur d’aiguilles et le filament chauffant sera au milieu du capillaire.
    5. Déplacez l’unité inférieure vers le haut, puis serrez le bouton inférieur. Assurez-vous que le capillaire est bien placé.
    6. Fermez le couvercle de l’extracteur d’aiguilles et appuyez sur Démarrer. Le voyant vert s’allume. Après quelques minutes, le capillaire sera chauffé et séparé pour se séparer en deux moitiés.
      REMARQUE: Les deux aiguilles séparées ne sont pas de la même longueur, mais elles peuvent toutes deux être utilisées pour les injections. Les points d’aiguille plus longs sont préférables.
    7. Disposez les aiguilles en position verticale avec leurs pointes vers le bas à l’aide d’un morceau de pâte à modeler. Alternativement, stockez les aiguilles dans une boîte de Pétri maintenue en place par deux bandes de pâte à modeler.
  3. Chargement de l’aiguille
    REMARQUE: La solution d’acide nucléique doit être centrifugée pendant au moins 10 min à 20 784 x g pour les impuretés de granulés qui peuvent être présentes dans la suspension. La centrifugation des impuretés les empêche de bloquer l’écoulement de l’aiguille d’injection.
    1. Utilisez l’une des deux méthodes pour charger les acides nucléiques dans les aiguilles.
    2. Méthode 1
      1. Utilisez une pipette pour transférer environ 0,5 μL de l’échantillon d’ADN centrifugé à l’extrémité non répulsée de l’aiguille d’injection. Cela apparaîtra comme une petite goutte de liquide assis sur le tube capillaire.
      2. Rester à l’écart pendant 5 à 7 min pour permettre à l’échantillon liquide d’occuper l’extrémité de l’aiguille. Le produit final sera une aiguille remplie sans bulles d’air.
      3. Utilisez un microscope à dissection pour confirmer la présence d’une solution dans la pointe de l’aiguille avant l’injection.
    3. Méthode 2
      1. Utilisez des conseils de chargement pour le micro-injecteur.
      2. À l’aide de cette pointe de chargement, pipette 5 μL de la solution d’acide nucléique.
      3. Pendant que l’aiguille tirée est sur l’extracteur d’aiguille, desserrez le bouton supérieur, déplacez légèrement l’aiguille tirée supérieure vers le haut et resserrez le bouton.
      4. Insérez soigneusement la pointe du chargeur dans le tube capillaire et étendez-la au fond de l’aiguille d’injection.
      5. Pipeter la solution d’acide nucléique dans l’aiguille d’injection.
      6. Retirez le chargeur de l’aiguille tirée et gardez-le séparé pour un chargement ultérieur, si nécessaire. Assurez-vous de changer de chargeur lorsque vous chargez un mélange d’acides nucléiques différent.
  4. Préparation du microscope d’injection
    REMARQUE: Un microscope inversé avec éclairage diffus de la base du microscope est utilisé pour la préparation des vers, la microinjection et la récupération. L’utilisation d’un microscope inversé à haute résolution avec des objectifs 10x et 40x est décrite. Le microscope est équipé d’un manipulateur d’aiguille qui maintient l’aiguille et la met en position pour l’injection. L’huile de micro-injection est utilisée pour empêcher le ver de déshydrater rapidement sur la couche d’agarose du tampon d’injection. L’huile suggérée à utiliser est Halocarbon Oil 700.
    1. Allumez la lampe et calibrez la luminosité avec le panneau de commande.
    2. Vérifiez le numéro sur le prisme de Wollaston du condenseur; il correspondra à l’objectif utilisé (40x).
    3. Vérifiez que la tourelle DIC, marquée par « DIC », est à la bonne position.
    4. Assurez-vous que le bouton de l’objectif est réglé à zéro (0).
    5. Tournez l’anneau Ph vers la droite jusqu’à la fin.
    6. Ajustez le polariseur de manière à ce que la flèche soit en position horizontale.
    7. Mettez un morceau de papier sur la scène pour observer le point focal (lumière).
    8. Fermez le diaphragme de champ au point qu’il y a une tache sur le papier.
    9. Utilisez le cadran à gauche pour déplacer le condenseur de haut en bas au point de voir une tache lumineuse très nette sur le papier morceau.
    10. Ouvrez lentement le diaphragme de champ jusqu’au point qu’un petit cercle de lumière est visible.
    11. Enlevez le morceau de papier.
    12. Assurez-vous que le point lumineux est au centre de l’objectif. Sinon, alignez le point lumineux avec le centre de l’objectif en ajustant les vis argentées sur le dessus du condenseur.
    13. Ouvrez complètement le diaphragme de champ.
    14. Vérifiez que l’analyseur ICT/P est enfoncé.
  5. Montage de l’aiguille d’injection sur le microscope
    1. Activez le flux d’azote gazeux vers l’aiguille de micro-injection. La pression du gaz sur l’aiguille sera d’environ 20 psi.
    2. Vérifiez que les boutons du micromanipulateur (la partie du microscope qui déplace l’aiguille) sont positionnés au centre, ce qui permet la plus grande amplitude de mouvement lorsque l’aiguille est montée.
    3. Dévissez l’ensemble qui maintient la tige métallique pour la retirer du porte-aiguille.
    4. Insérez la nouvelle aiguille dans la partie supérieure du microscope; puis installez le joint en caoutchouc pour maintenir l’aiguille en position.
    5. Fixez la partie inférieure du porte-aiguille en l’ajustant à l’assemblage.
    6. Placez l’aiguille dans la rainure du micromanipulateur et vissez-la correctement pour la maintenir stable. Assurez-vous que la vis se trouve à environ 1 po de l’extrémité du micromanipulateur.
    7. Placez la pointe de l’aiguille au milieu du champ visuel à un angle d’environ 45 ° par rapport à la plaque de scène, en utilisant les boutons et les commandes grossières du micromanipulateur. Il est essentiel de laisser la pointe de l’aiguille suffisamment haute pour qu’elle ne se brise pas par accident.
  6. Casser les aiguilles
    1. Placez l’aiguille dans le micromanipulateur à l’endroit où la pointe de l’aiguille se brisera normalement pour permettre à la solution d’acide nucléique de la traverser.
    2. Cassez un capillaire et placez-le sur une lame de verre transportant une goutte d’huile de micro-injection.
    3. Placez la lame sur le microscope et faites la mise au point.
    4. Amener la pointe de l’aiguille au même niveau que le côté capillaire à l’aide des commandes fines du microscope (Figure 4).
    5. Activez brièvement le débit d’azote à l’aide de l’actionneur du pied pour confirmer que la pointe de l’aiguille n’est pas cassée. Une mise en marche-arrêt rapide suffira.
    6. Déplacez doucement l’aiguille pour qu’elle touche à peine le côté du capillaire.
    7. Appuyez légèrement sur le côté du microscope pour casser la pointe de l’aiguille.
    8. Retirez l’aiguille du capillaire et activez le flux d’azote pour vérifier que l’aiguille est cassée correctement.
    9. L’aiguille créera une petite goutte d’injection environ cinq fois plus grande que la pointe de l’aiguille (Figure 4). Si la goutte d’injection est de plus petite taille, cassez la pointe plus loin. Si la gouttelette d’injection est de plus grande taille, essayez d’utiliser une aiguille fraîche.

6. Microinjection

  1. Pipette une goutte d’huile de micro-injection sur un tampon d’injection.
  2. Trempez un pic stérilisé à la flamme dans la goutte d’huile de micro-injection et recueillez un jeune H. nématode adulte bacteriophora de la plaque.
  3. Choisissez les nématodes dans les parties de la plaque qui ne sont pas proches de la pelouse bactérienne pour empêcher le transfert d’un grand nombre de cellules bactériennes vers le tampon d’injection. En outre, récoltez un nématode avec des gonades bien formées.
  4. Déplacez les nématodes vers le tampon d’injection et positionnez-les verticalement de sorte que les gonades fassent face à l’aiguille. Assurez-vous que la vulve pointe dans la même direction que l’aiguille d’injection et que les deux bras gonivaux distaux sont dans la direction opposée et contre la paroi corporelle du nématode.
    REMARQUE: Comme Pristionchus pacificus, la gonade de H. bacteriophora migre dorsalement de la position vulvaire ventrale, puis migre vers la position ventrale.
  5. Vérifiez que la quantité d’huile est suffisante pour empêcher la dessiccation des nématodes sans permettre au nématode de se promener.
  6. Mettez le nématode au point avec l’objectif 10x en tenant l’aiguille bien au-dessus de la glissière. Dans l’huile, les gonades nématodes sont considérées comme deux régions claires proches de l’avant et du postérieur du ver. Assurez-vous que les gonades sont au centre de l’attention et non les autres parties du ver.
  7. Disposez le nématode à un angle de 15° à 45° vers l’aiguille d’injection, ce qui donnera plus d’espace à l’aiguille à l’intérieur de la gonade. En outre, cette approche empêche l’aiguille de traverser tout le corps du nématode lorsque l’aiguille est introduite à l’intérieur de la gonade.
  8. Placez l’aiguille d’injection et le nématode au même niveau en abaissant progressivement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit mise au point (Figure 5). Assurez-vous que lorsque l’aiguille est abaissée, elle reste à côté du nématode et non au-dessus du ver.
  9. Utilisez l’objectif 40x pour vous concentrer sur le bras gonflé syncytial du nématode.
  10. Déplacez l’aiguille de haut en bas à l’aide du réglage fin jusqu’à ce que la pointe soit mise au point avec le bras de gonade syncytiale nématode.
  11. Déplacez le nématode lentement vers l’aiguille à l’aide de l’étage de glissement. Ensuite, poussez doucement la gonade pour la positionner avec l’aiguille contre la paroi corporelle du nématode, ce qui entraînera une pénétration efficace de l’aiguille à l’intérieur du corps du nématode.
  12. Appuyez brièvement sur l’actionneur du pied pour démarrer le flux de la solution d’acide nucléique. Une mise en marche-arrêt rapide suffit. Si l’aiguille est à l’intérieur de la gonade, la gonade se remplira de la solution et gonflera.
  13. Une fois que l’aiguille est assurée dans la bonne position, remplissez la gonade avec la solution d’acide nucléique jusqu’à ce que les bras de la gonade soient remplis. Il est important d’éviter l’expulsion du liquide du ver par le trou où l’aiguille l’a perforé.
  14. À l’aide de l’étage coulissant, éloignez soigneusement le ver de l’aiguille.
  15. Soulevez l’aiguille et tournez-la dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
  16. Placez une goutte de tampon PBS 1x sur le ver pour le faire flotter.
  17. Utilisez le pic stérilisé à la flamme pour soulever le ver et placez-le dans une autre goutte de M9 sur une plaque fraîche ensemencée de P. luminescens pour débarrasser le ver de l’excès d’huile.
  18. Retirez le nématode du M9 et placez-le de l’autre côté de la pelouse bactérienne.
  19. Utilisez la même plaque pour transférer plusieurs nématodes injectés.
  20. Dans 2-3 jours, évaluez les nématodes de première génération (F1) pour le phénotype transgénique. Séparez les nématodes transgéniques F1 sur des plaques individuelles pour déterminer quels vers généreront des lignées transgéniques stables.

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Résultats

Pour évaluer le statut des nématodes H. bacteriophora qui ont subi l’axenisation, la présence ou l’absence de colonies bactériennes de P. luminescens dans les IJ a été déterminée. Pour ce faire, une pastille d’environ 500 UI qui avait déjà été stérilisée en surface et homogénéisée dans le PBS a été collectée. Le traitement témoin positif consistait en une pastille d’environ 500 IJ provenant de la culture de nématodes contenant des bactéries symbiotiques P. luminescens . Les pastilles de nématod...

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Discussion

Comprendre la base moléculaire de l’infection par les nématodes entomopathogènes et de l’immunité anti-nématodes des insectes nécessite la séparation des parasites des bactéries associées mutuellement 13,15,16. Les nématodes entomopathogènes H. bacteriophora et S. carpocapsae vivent respectivement avec les bactéries à Gram négatif P. luminescens et X. nematophila,respectiveme...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Nous remercions les membres du Département des sciences biologiques de l’Université George Washington pour leur lecture critique du manuscrit. Toutes les figures graphiques ont été réalisées à l’aide de BioRender. Recherche dans l’I. E., J. H., et D. O’H. les laboratoires ont été soutenus par l’Université George Washington et le Columbian College of Arts and Sciences, facilitant les fonds et les fonds de recherche interdisciplinaires.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgaroseVWR97062-244
Ambion Megascript T7 KitThermo Fisher ScientificAM1333
AmpicillineFisher Scientific611770250
Flacon de culture cellulaire T25Fisher Scientific156367
Flacon de culture cellulaire T75Fisher Scientific156499
ChoiceTaq MastermixDenville ScientificC775Y42
Huile de maïsVWR470200-112
Sirop de maïsMP Biomedicals/VWRIC10141301
Tube de culture 10 mLFisher Scientific14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader TipsEppendorfE5242956003
EthanolMillipore-SigmaE7023
Tube Falcon 50 mLFisher Scientific14-432-22
Microinjecteur FemtojetEppendorf5252000021
Papier filtreVWR28320-100
Galleria mellonella waxormsPetco-Glass
CoverslipFisher Scientific12-553-46450 x 24 mm
Huile halocarbure 700SigmaH8898
Boucle d’inoculationVWR12000-806
KanamycinVWR97062-956
Kwik-Fil Capillaires en verre borosilicatéWorld Precision Instruments1B100F-31.0 mm
LB AgarFisher ScientificBP1425-500LB Poudre de broyeur d’agar 500 g
LB BouillonFisher ScientificBP1426-500LB Poudre de broyeur de bouillon 500 g
Leica DM IRB Microscope de recherche inverséMicroscopeCentral-MacConkey
mediumMillipore-SigmaM7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit ThermoFisher ScientificAM1908
Tube de microcentrifugationVWR76332-0641,5 ml
NanoDrop 2000 SpectrophotomètreThermo Fisher ScientificND-2000
Seringue à aiguilleVWRBD30515522G
Bouillon nutritifMillipore-Sigma70122-100G
ParafilmVWR52858-076
Boîte de Pétri cloisonnéeVWR490005-212
PBSVWR97062-732Tampon PBS comprimés amorces PCR de qualité biotech 200
comprimésAzenta-Pestle
Millipore-SigmaBAF199230001Bel-Art Boîte
Pétri jetableVWR25384-09260 x 15 mm
Boîte de Pétri 10 mmVWR10799-19235 x 10 mm
Peptone Protéose #3Thermo Fisher Scientific
Levure extraitMillipore-SigmaY1625
de pilon 6 cm 211693

Références

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