Mycobacterium tuberculosis Enrichissement extracellulaire des vésicules par chromatographie d’exclusion de taille
Summary
Ce protocole décrit la chromatographie d’exclusion de taille, une technique facile et reproductible pour enrichir les vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis à partir de surnageants de culture.
Abstract
Le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans le contexte de l’infection bactérienne est apparu comme une nouvelle voie pour comprendre la physiologie microbienne. Plus précisément, les VE de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) jouent un rôle dans l’interaction hôte-pathogène et la réponse au stress environnemental. Les VE MTB sont également très antigéniques et présentent un potentiel en tant que composants du vaccin. La méthode la plus courante pour purifier les véhicules électriques vtt est l’ultracentrifugation par gradient de densité. Ce processus présente plusieurs limites, notamment un faible débit, un faible rendement, une dépendance à l’égard d’équipements coûteux, des défis techniques et peut avoir un impact négatif sur la préparation qui en résulte. La chromatographie d’exclusion de taille (SEC) est une méthode alternative plus douce qui combat bon nombre des limites de l’ultracentrifugation. Ce protocole démontre que SEC est efficace pour l’enrichissement des vtt EV et produit des préparations Mtb EV de haute qualité avec un rendement accru de manière rapide et évolutive. De plus, une comparaison avec l’ultracentrifugation du gradient de densité par des procédures de quantification et de qualification démontre les avantages de la SEC. Bien que l’évaluation de la quantité de VE (analyse de suivi des nanoparticules), du phénotype (microscopie électronique à transmission) et du contenu (Transfert western) soit adaptée aux véhicules électriques vtt, le flux de travail fourni peut être appliqué à d’autres mycobactéries.
Introduction
La libération de vésicules extracellulaires (VE) par des agents pathogènes peut être la clé pour déverrouiller de nouvelles technologies pour contrôler les maladies infectieuses1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un agent pathogène de grande importance, infectant environ un tiers de la population mondiale et coûtant la vie à des millions de personnes chaque année2. La production de VE par Mtb est bien documentée mais insaisissable dans la biogenèse et les rôles variés (c.-à-d. immunostimulant, immunosuppresseur, acquisition de fer et de nutriments) de ces VE dans le contexte de l’infection 3,4,5. Les efforts pour comprendre la composition des VE Mtb ont révélé des sphères enveloppées de membrane lipidique de 50 à 150 nm dérivées de la membrane plasmique contenant des lipides et des protéines d’importance immunologique 3,6. L’étude du rôle des VE VTT dans la physiologie bactérienne a révélé l’importance de la modulation bactérienne ev en réponse au stress environnemental pour la survie5. Les études d’interaction hôte-pathogène ont été plus compliquées à interpréter, mais les preuves indiquent que les VE MTB peuvent influencer la réponse immunitaire de l’hôte et peuvent potentiellement servir de composante vaccinale efficace 3,4,7.
Jusqu’à présent, la plupart des études sur les véhicules électriques VTT se sont appuyées sur l’ultracentrifugation par gradient de densité pour l’enrichissement des vésicules8. Cela a été efficace pour les études à petite échelle; cependant, cette technique présente plusieurs défis techniques et logistiques. Des flux de travail alternatifs associent la centrifugation en plusieurs étapes, pour l’élimination des cellules entières et des gros débris, à une étape finale d’ultracentrifugation pour pelleter les véhicules électriques. Cette méthodologie peut varier en efficacité et entraîne souvent un faible rendement et une co-purification des biomolécules solubles non associées aux vésicules tout en ayant un impact sur l’intégrité des vésicules9. De plus, ce processus prend beaucoup de temps, est manuel et son débit est très limité en raison des contraintes de l’équipement.
Le présent protocole décrit une technique alternative à l’ultracentrifugation par gradient de densité : la chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Cette méthode a été démontrée pour les mycobactéries environnementales, et dans les travaux actuels, elle a été extrapolée à Mtb10. Une colonne disponible dans le commerce et un collecteur de fraction automatique peuvent améliorer la cohérence de la préparation vésicale et réduire la nécessité d’un équipement spécifique et coûteux. Il est également possible de compléter ce protocole en une fraction du temps par rapport à l’ultracentrifugation à gradient de densité, ce qui augmente le débit. Cette technique est moins difficile techniquement, ce qui la rend plus facile à maîtriser, et peut augmenter la reproductibilité inter/intra-laboratoire. Enfin, le SEC a une efficacité de séparation élevée et est doux, préservant l’intégrité des vésicules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les vésicules extracellulaires de Mycobacterium tuberculosis sont des réservoirs hautement antigéniques, ce qui les présente comme une avenue attrayante pour le développement d’outils de diagnostic et de futurs vaccins 4,19,20. Historiquement, l’ultracentrifugation par gradient de densité a été utilisée pour séparer les VÉHICULES VTT d’autres matériaux solubles et sécrétés8. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous aimerions remercier le college of veterinary medicine and biomedical sciences Experiential Award et le College Research Council Shared Research Program à NKG et le financement de l’ATCC (prix # 2016-0550-0002) à KMD. Nous tenons également à remercier Anne Simpson pour son soutien technique et BEI Resources, NIAID, NIH pour les réactifs suivants : Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produit in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produit in vitro), NR-49223, et Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produit in vitro), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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