Mycobacterium tuberculosis Extrazelluläre Vesikelanreicherung durch Größenausschlusschromatographie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Größenausschlusschromatographie, eine einfache und reproduzierbare Technik zur Anreicherung von Mycobacterium tuberculosis extrazellulären Vesikeln aus Kulturüberständen.
Abstract
Die Rolle extrazellulärer Vesikel (EVs) im Zusammenhang mit bakteriellen Infektionen hat sich als neuer Weg zum Verständnis der mikrobiellen Physiologie herauskristallisiert. Insbesondere Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EVs spielen eine Rolle bei der Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserregern und der Reaktion auf Umweltstress. Mtb EVs sind auch stark antigen und zeigen Potenzial als Impfstoffkomponenten. Die gebräuchlichste Methode zur Reinigung von Mtb-EVs ist die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Dieser Prozess hat mehrere Einschränkungen, einschließlich geringem Durchsatz, geringer Ausbeute, Abhängigkeit von teurer Ausrüstung, technischen Herausforderungen und kann sich negativ auf die resultierende Vorbereitung auswirken. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist eine sanftere alternative Methode, die viele der Einschränkungen der Ultrazentrifugation bekämpft. Dieses Protokoll zeigt, dass SEC für die Mtb EV-Anreicherung wirksam ist und qualitativ hochwertige Mtb EV-Präparate mit erhöhtem Ertrag auf schnelle und skalierbare Weise produziert. Darüber hinaus zeigt ein Vergleich mit der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation durch Quantifizierungs- und Qualifizierungsverfahren die Vorteile von SEC. Während die Bewertung der EV-Menge (Nanopartikel-Tracking-Analyse), des Phänotyps (Transmissionselektronenmikroskopie) und des Inhalts (Western Blotting) auf Mtb-EVs zugeschnitten ist, kann der bereitgestellte Workflow auf andere Mykobakterien angewendet werden.
Introduction
Die Freisetzung extrazellulärer Vesikel (EV) durch Krankheitserreger kann der Schlüssel zur Erschließung neuer Technologien zur Bekämpfung von Infektionskrankheitensein 1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ist ein Erreger von hoher Tragweite, der etwa ein Drittel der Weltbevölkerung infiziert und jedes Jahr Millionen von Menschen das Leben fordert2. Die EV-Produktion durch Mtb ist gut dokumentiert, aber schwer fassbar in der Biogenese und den verschiedenen Rollen (d.h. immunstimulierend, immunsuppressiv, Eisen- und Nährstoffakquisition) dieser EVs im Zusammenhang mit der Infektion 3,4,5. Bemühungen, die Zusammensetzung von Mtb-EVs zu verstehen, zeigten 50-150 nm Lipidmembran-umschlossene Kugeln, die aus der Plasmamembran stammen, die Lipide und Proteine von immunologischer Bedeutung enthält 3,6. Die Untersuchung der Rolle von Mtb-EVs in der bakteriellen Physiologie hat die Bedeutung der bakteriellen EV-Modulation als Reaktion auf Umweltstress für das Überlebengezeigt 5. Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien waren komplizierter zu interpretieren, aber es gibt Hinweise darauf, dass Mtb-EVs die Immunantwort des Wirts beeinflussen können und möglicherweise als wirksame Impfkomponentedienen können 3,4,7.
Die meisten Studien an Mtb-EVs haben sich bisher auf die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation für die Vesikelanreicherungverlassen 8. Dies hat sich für kleine Studien als wirksam erwiesen; Diese Technik hat jedoch mehrere technische und logistische Herausforderungen. Alternative Workflows koppeln die mehrstufige Zentrifugation zur Entfernung ganzer Zellen und großer Ablagerungen mit einem abschließenden Ultrazentrifugationsschritt zur Pelletierung von Elektrofahrzeugen. Diese Methodik kann in ihrer Effizienz variieren und führt oft zu einer geringen Ausbeute und Mitreinigung löslicher nicht-vesikelassoziierter Biomoleküle und beeinflusst gleichzeitig die Vesikelintegrität9. Darüber hinaus ist dieser Prozess zeitaufwändig, manuell intensiv und aufgrund von Gerätebeschränkungen sehr begrenzt im Durchsatz.
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine alternative Technik zur Dichtegradienten-Ultrazentrifugation: die Größenausschlusschromatographie (SEC). Diese Methode wurde für Umweltmykobakterien demonstriert und in der aktuellen Arbeit auf Mtb10 extrapoliert. Eine handelsübliche Säule und ein automatischer Fraktionssammler können die Konsistenz bei der vesikalen Vorbereitung verbessern und die Notwendigkeit für spezifische, teure Geräte reduzieren. Es ist auch möglich, dieses Protokoll in einem Bruchteil der Zeit im Vergleich zur Dichtegradienten-Ultrazentrifugation abzuschließen, wodurch der Durchsatz erhöht wird. Diese Technik ist technisch weniger anspruchsvoll, was die Beherrschung erleichtert und die Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb des Labors erhöhen kann. Schließlich hat SEC eine hohe Abscheideeffizienz und ist schonend, wobei die Integrität der Vesikel erhalten bleibt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mycobacterium tuberculosis extrazelluläre Vesikel sind stark antigene Reservoirs, die sie als attraktiven Weg für die Entwicklung von Diagnosewerkzeugen und zukünftigen Impfstoffendarstellen 4,19,20. In der Vergangenheit wurde die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendet, um Mtb-EVs von anderem löslichen, sezernierten Materialzu trennen 8. Während dieser Prozess effektiv ist, ist er au…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten uns für die Unterstützung des College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award und des College Research Council Shared Research Program für NKG und die Finanzierung durch ATCC (Award # 2016-0550-0002) für KMD bedanken. Wir möchten auch Anne Simpson für die technische Unterstützung und BEI Resources, NIAID, NIH für die folgenden Reagenzien danken: Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gen Rv3763), IT-54 (produziert in vitro), NR-13792, Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produziert in vitro), NR-49223 und Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produziert in vitro), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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