Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale
Summary
Questo protocollo descrive la cromatografia di esclusione dimensionale, una tecnica facile e riproducibile per arricchire le vescicole extracellulari del Mycobacterium tuberculosis dai supernatanti di coltura.
Abstract
Il ruolo delle vescicole extracellulari (EV) nel contesto dell’infezione batterica è emerso come una nuova strada per comprendere la fisiologia microbica. In particolare, i veicoli elettrici Mycobacterium tuberculosis (Mtb) svolgono un ruolo nell’interazione ospite-patogeno e nella risposta allo stress ambientale. I veicoli elettrici Mtb sono anche altamente antigenici e mostrano un potenziale come componenti del vaccino. Il metodo più comune per purificare i veicoli elettrici Mtb è l’ultracentrifugazione del gradiente di densità. Questo processo presenta diverse limitazioni, tra cui bassa produttività, bassa resa, dipendenza da attrezzature costose, sfide tecniche e può avere un impatto negativo sulla preparazione risultante. La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è un metodo alternativo più delicato che combatte molte delle limitazioni dell’ultracentrifugazione. Questo protocollo dimostra che SEC è efficace per l’arricchimento Mtb EV e produce preparazioni Mtb EV di alta qualità di maggiore resa in modo rapido e scalabile. Inoltre, un confronto con l’ultracentrifugazione del gradiente di densità mediante procedure di quantificazione e qualificazione dimostra i vantaggi della SEC. Mentre la valutazione della quantità ev (analisi del tracciamento delle nanoparticelle), del fenotipo (microscopia elettronica a trasmissione) e del contenuto (Western blotting) è adattata ai veicoli elettrici Mtb, il flusso di lavoro fornito può essere applicato ad altri micobatteri.
Introduction
Il rilascio di vescicole extracellulari (EV) da parte di agenti patogeni può essere la chiave per sbloccare nuove tecnologie per controllare le malattie infettive1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è un agente patogeno di alta conseguenza, che infetta circa un terzo della popolazione mondiale e reclama la vita di milioni di persone ogni anno2. La produzione di VEICOLI ELETTRICI da parte di Mtb è ben documentata ma sfuggente nella biogenesi e nei vari ruoli (cioè immunostimolante, immunosoppressiva, ferro e acquisizione di nutrienti) di questi veicoli elettrici nel contesto dell’infezione 3,4,5. Gli sforzi per comprendere la composizione dei veicoli elettrici Mtb hanno rivelato sfere chiuse con membrana lipidica a 50-150 nm derivate dalla membrana plasmatica contenenti lipidi e proteine di significato immunologico 3,6. Lo studio del ruolo dei veicoli elettrici Mtb nella fisiologia batterica ha rivelato l’importanza della modulazione batterica ev in risposta allo stress ambientale per la sopravvivenza5. Gli studi di interazione ospite-patogeno sono stati più complicati da interpretare, ma le prove indicano che i veicoli elettrici Mtb possono influenzare la risposta immunitaria dell’ospite e possono potenzialmente servire come componente di vaccinazione efficace 3,4,7.
La maggior parte degli studi sui veicoli elettrici Mtb finora si sono basati sull’ultracentrifugazione del gradiente di densità per l’arricchimento dellevescicole 8. Questo è stato efficace per studi su piccola scala; tuttavia, questa tecnica presenta diverse sfide tecniche e logistiche. Flussi di lavoro alternativi accoppiano la centrifugazione multistep, per la rimozione di intere celle e detriti di grandi dimensioni, con una fase finale di ultracentrifugazione ai veicoli elettrici a pellet. Questa metodologia può variare in termini di efficienza e spesso si traduce in una bassa resa e co-purificazione di biomolecole solubili non associate alle vescicole, influenzando anche l’integrità dellevescicole 9. Inoltre, questo processo richiede molto tempo, richiede un uso manuale e un throughput molto limitato a causa dei vincoli delle apparecchiature.
Il presente protocollo descrive una tecnica alternativa all’ultracentrifugazione a gradiente di densità: la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC). Questo metodo è stato dimostrato per i micobatteri ambientali e nel lavoro attuale è stato estrapolato a Mtb10. Una colonna disponibile in commercio e un collettore automatico di frazioni possono migliorare la coerenza nella preparazione vescicale e ridurre la necessità di attrezzature specifiche e costose. È anche possibile completare questo protocollo in una frazione del tempo rispetto all’ultracentrifugazione del gradiente di densità, aumentando la produttività. Questa tecnica è meno impegnativa dal punto di vista tecnico, rendendola più facile da padroneggiare e può aumentare la riproducibilità inter/intra-laboratorio. Infine, SEC ha un’elevata efficienza di separazione ed è delicato, preservando l’integrità delle vescicole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le vescicole extracellulari di Mycobacterium tuberculosis sono serbatoi altamente antigenici, che li presentano come una strada attraente per lo sviluppo di strumenti diagnostici e futuri vaccini 4,19,20. Storicamente, l’ultracentrifugazione del gradiente di densità è stata utilizzata per separare i veicoli elettrici Mtb da altri materiali solubili e secreti8. Sebbene questo processo sia effica…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere il sostegno del College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award e del College Research Council Shared Research Program a NKG e il finanziamento da parte di ATCC (premio # 2016-0550-0002) a KMD. Vorremmo anche ringraziare Anne Simpson per il supporto tecnico e BEI Resources, NIAID, NIH per i seguenti reagenti: Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (prodotto in vitro), NR-13792, Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (prodotto in vitro), NR-49223 e Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (prodotto in vitro), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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