Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho
Summary
Este protocolo descreve a cromatografia de exclusão de tamanho, uma técnica fácil e reprodutível para enriquecer as vesículas extracelulares mycobacterium tuberculosis de supernascedores culturais.
Abstract
O papel das vesículas extracelulares (EVs) no contexto da infecção bacteriana surgiu como um novo caminho para a compreensão da fisiologia microbiana. Especificamente, os EVs Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempenham um papel na interação hospedeiro-patógeno e na resposta ao estresse ambiental. Os EVs Mtb também são altamente antigênicos e mostram potencial como componentes de vacinas. O método mais comum para purificar EVs Mtb é a ultracentrifugação gradiente de densidade. Esse processo tem várias limitações, incluindo baixo rendimento, baixo rendimento, dependência de equipamentos caros, desafios técnicos, podendo impactar negativamente a preparação resultante. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) é um método alternativo mais suave que combate muitas das limitações da ultracentrifugação. Este protocolo demonstra que a SEC é eficaz para o enriquecimento de EV Mtb e produz preparações de EV Mtb de alta qualidade de maior rendimento de forma rápida e escalável. Além disso, uma comparação com a ultracentrifugação de gradiente de densidade por procedimentos de quantificação e qualificação demonstra os benefícios da SEC. Enquanto a avaliação da quantidade de EV (análise de rastreamento de nanopartículas), fenótipo (microscopia eletrônica de transmissão) e conteúdo (mancha ocidental) é adaptado para EVs Mtb, o fluxo de trabalho fornecido pode ser aplicado a outras micobactérias.
Introduction
A liberação de vesícula extracelular (EV) por patógenos pode ser a chave para desbloquear novas tecnologias para controlar doenças infecciosas1. A micobacterium tuberculosis (Mtb) é um patógeno de alta consequência, infectando aproximadamente um terço da população mundial e reivindicando a vida de milhões de pessoas a cada ano2. A produção de EV por Mtb é bem documentada, mas evasiva nos papéis biogêneses e variados (ou seja, imunoestimulatório, imunossupressor, aquisição de ferro e nutrientes) desses EVs no contexto da infecção 3,4,5. Os esforços para entender a composição dos EVs Mtb revelaram esferas lipídicas de 50-150 nm de membrana lipídica derivadas da membrana plasmática contendo lipídios e proteínas de significância imunológica 3,6. A investigação do papel dos EVs de Mtb na fisiologia bacteriana revelou a importância da modulação bacteriana de EV em resposta ao estresse ambiental para a sobrevivência5. Estudos de interação hospedeiro-patógeno têm sido mais complicados de interpretar, mas evidências indicam que os EVs Mtb podem influenciar a resposta imune do hospedeiro e podem potencialmente servir como um componente de vacinação eficaz 3,4,7.
A maioria dos estudos de EVs Mtb até agora tem se apoiado na ultracentrifugação gradiente de densidade para o enriquecimento vesícula8. Isso tem sido eficaz para estudos de pequena escala; no entanto, essa técnica tem diversos desafios técnicos e logísticos. Fluxos de trabalho alternativos casam centrifugação multistep, para a remoção de células inteiras e detritos grandes, com um passo final de ultracentrifugação para eVs de pelotização. Essa metodologia pode variar em eficiência, e muitas vezes resulta em baixo rendimento e co-purificação de biomoléculas não vesículas solúveis associadas, ao mesmo tempo em que impacta a integridade vesícula9. Além disso, esse processo é demorado, manualmente intensivo e muito limitado em rendimento devido a restrições de equipamentos.
O presente protocolo descreve uma técnica alternativa à ultracentrifugação gradiente de densidade: cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Este método tem sido demonstrado para micobactérias ambientais, e no trabalho atual, foi extrapolado para Mtb10. Uma coluna comercialmente disponível e coletor de frações automática pode melhorar a consistência na preparação vesical e reduzir a necessidade de equipamentos específicos e caros. Também é possível completar este protocolo em uma fração do tempo em comparação com a ultracentrifugação gradiente de densidade, aumentando o throughput. Esta técnica é menos tecnicamente desafiadora, facilitando o domínio, e pode aumentar a reprodutibilidade inter/intra-laboratorial. Finalmente, a SEC tem alta eficiência de separação e é gentil, preservando a integridade das vesículas.
Protocol
Representative Results
Discussion
As vesículas extracelulares de micobacterium tuberculosis são reservatórios altamente antigênicos, que os apresentam como um caminho atraente para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico e vacinas futuras 4,19,20. Historicamente, a ultracentrifugação de gradiente de densidade tem sido usada para separar EVs Mtb de outros materiais solúveis e secretos8. Embora esse processo seja ef…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer o apoio do Prêmio Experiencial de Medicina Veterinária e Ciências Biomédicas e do Conselho de Pesquisa Universitária ao NKG e financiamento da ATCC (prêmio nº 2016-0550-0002) ao KMD. Também gostaríamos de reconhecer Anne Simpson por suporte técnico e recursos BEI, NIAID, NIH para os seguintes reagentes: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produzido in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produzido in vitro), NR-49223, e Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produzido in vitro), NR-13811.
Materials
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- . Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022)
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
