كهربية الحمض النووي البلازميد في العضلات الهيكلية للفأر
Summary
يعد تحويل الحمض النووي البلازميدي بالكهرباء إلى العضلات الهيكلية طريقة قابلة للتطبيق لتعديل التعبير الجيني دون المساس بانقباض العضلات لدى الفئران.
Abstract
يعد تعديل التعبير الجيني العابر في العضلات الهيكلية الفئرانية بواسطة بالكهرباء البلازميدية أداة مفيدة لتقييم الفسيولوجيا الطبيعية والمرضية. إن الإفراط في التعبير عن الجينات المستهدفة أو إسقاطها يمكن الباحثين من التعامل مع الأحداث الجزيئية الفردية ، وبالتالي فهم أفضل للآليات التي تؤثر على كتلة العضلات ، واستقلاب العضلات ، والانقباض. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إلكتروبورات بلازميدات الحمض النووي التي تشفر علامات الفلورسنت تسمح للباحثين بقياس التغيرات في التوطين تحت الخلوي للبروتينات في العضلات الهيكلية في الجسم الحي. يتضمن التقييم الوظيفي الرئيسي للعضلات الهيكلية قياس انقباض العضلات. في هذا البروتوكول ، نثبت أن دراسات انقباض العضلات الكاملة لا تزال ممكنة بعد حقن الحمض النووي البلازميد ، والكهربية ، وتعديل التعبير الجيني. الهدف من هذا الإجراء التعليمي هو إظهار الطريقة خطوة بخطوة للبلازميد الكهربائي للحمض النووي في العضلات الهيكلية للفأر لتسهيل الامتصاص والتعبير في الألياف العضلية للعضلات الطويلة الأمامية والباسطة الرقمية ، وكذلك لإثبات أن انقباض العضلات الهيكلية لا يتعرض للخطر عن طريق الحقن والكهرب.
Introduction
يعد كهربية الحمض النووي البلازميدي في العضلات الهيكلية في الجسم الحي أداة مهمة لتقييم التغيرات في فسيولوجيا العضلات الهيكلية والإشارات الجزيئية عن طريق تعديل التعبير الجيني في مجموعة متنوعة من الحالات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية1،2،3،4،5،6،7،8،9 . تم إثبات نقل الجينات التجريبية إلى العضلات الهيكلية في وقت مبكر من عام 1990 من قبل وولف وآخرون ، حيث تم نقل كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي بنجاح دون كهربية ، وتم الحفاظ على تعبير luciferase لمدة شهرين على الأقل10. إن كفاءة النقل المنخفضة نسبيا مع الحقن فقط تمثل مشكلة ، وقد أظهر أيهارا وميازاكي زيادة في نقل الجينات باستخدام الكهربية في عام 1998 عن طريق كهربية بناء pCAGGS-IL-5 في عضلة الظنبوب الأمامية (TA) وقياس تعبير المصل IL-511. منذ ذلك الوقت ، حققت العديد من الدراسات في فعالية تركيزات الحمض النووي المختلفة ، والأحجام ، ومعلمات الكهربية لضمان أقصى قدر من كفاءة نقل الجينات. اختبر مير وآخرون معلمات كهربائية مختلفة ، بما في ذلك الجهد ، وعدد النبض ، ومدة النبض ، والتردد ، بالإضافة إلى تركيز الحمض النووي ، وقرروا أن زيادة الجهد ، وعدد النبضات ، وتركيز الحمض النووي كلها ساهمت في زيادة كفاءة الكهربية12. أحد التحذيرات الرئيسية من الجهد الكهربائي العالي هو أنه في حين أنه يسهل زيادة امتصاص الحمض النووي في الألياف العضلية ، فإنه يسبب أيضا تلفا في العضلات ، مما قد يؤدي إلى إرباك النتائج. أظهر Schertzer et al. أن الكهربية عند 200 فولت تسببت في تلف حوالي 50٪ من الألياف العضلية بعد 3 أيام من المسام الكهربائية ، في حين أن 10٪ فقط من الألياف العضلية تضررت عند 50 فولت13. لقد أخذنا في الاعتبار المتغيرات التي تؤثر على نقل الحمض النووي بكفاءة مقابل تلف العضلات ووجدنا أن الجهد البالغ 125 فولت في المائة من عرض الفرجار يكفي لتحقيق نقل فعال للجينات.
يعد تحليل منطقة المقطع العرضي لألياف العضلات وانقباض العضلات بالكامل بعد الكهربية من الجوانب المهمة لطريقة قياس التغيرات في حجم العضلات ووظيفتها بسبب تعديل الجينات. لقد أثبتنا نحن وآخرون سابقا أن كهربية ناقلات المكافحة وحدها لا تسبب انخفاضا في منطقة الألياف العضلية. كان بناء بروتين الفلورسنت الأخضر (EGFP) مؤشرا فلوريا مفيدا لنقل الحمض النووي في هذه الدراسات13,14. قام عدد من الدراسات بالتحقيق في انقباض TA في الموقع بعد الكهربية ووجدوا نتائج متفاوتة. أظهرت إحدى الدراسات أن الكهربية 75 فولت / سم تسببت في انخفاض بنسبة 30٪ في قوة الكزاز بعد 3 أيام من الكهربية ، وبحلول 7 أيام بعد الكهربية ، عادت قوة الكزاز إلى مستوى التحكم ، في حين أن 50 فولت / سم من الكهربية لم تؤثر على القوة13,15. أظهرت دراسة أخرى أن هناك فقدانا بنسبة 30٪ لقوة الكزاز 3 ساعات بعد 180 فولت / سم من الكهرباء ، والتي تعافت إلى مستويات القوة الزائفة بعد 7 أيام16.
في الإجراء التفصيلي التالي ، نوضح الحقن والكهربية لبلازميد pcDNA3-EGFP في عضلات TA والعضلات الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) للفئران. كما نثبت أن هذه الطريقة لا تؤثر على انقباض العضلات بالكامل لدى EDL. والهدف من ذلك هو إظهار كفاءة امتصاص البلازميد في الألياف العضلية دون التسبب في فقدان الوظيفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الجسم الحي ، يعد نقل الجينات في العضلات الهيكلية المعززة بالكهرباء أداة مفيدة وبسيطة نسبيا لتعديل تعبير البروتين في العضلات. لقد أظهرنا الخطوات المطلوبة لتحقيق نقل فعال للجينات في عضلات EDL و TA وأثبتنا أن قياس الانقباض في EDL قابل للتطبيق بعد الإجراء. لا تتطلب هذه التقنية ناقلات فيرو…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
References
- Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
- Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
- Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
- Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
- Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
- Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
- Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
- Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
- Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
- Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
- Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
- Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
- Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
- Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
- Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
- Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
- Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
- Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
- Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
- Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).
