Elektroporation af plasmid-DNA i musens skeletmuskel

Summary

Elektroporation af plasmid-DNA i skeletmuskulatur er en levedygtig metode til at modulere genekspression uden at gå på kompromis med muskelkontraktilitet hos mus.

Abstract

Transient genekspressionsmodulation i murine skeletmuskulatur ved plasmidelektroporation er et nyttigt værktøj til vurdering af normal og patologisk fysiologi. Overekspression eller knockdown af målgener gør det muligt for efterforskere at manipulere individuelle molekylære begivenheder og dermed bedre forstå de mekanismer, der påvirker muskelmasse, muskelmetabolisme og kontraktilitet. Derudover giver elektroporation af DNA-plasmider, der koder for fluorescerende tags, efterforskere mulighed for at måle ændringer i subcellulær lokalisering af proteiner i skeletmuskulatur in vivo. En vigtig funktionel vurdering af skeletmuskulatur omfatter måling af muskelkontraktilitet. I denne protokol viser vi, at undersøgelser af hele muskelkontraktilitet stadig er mulige efter plasmid-DNA-injektion, elektroporation og genekspressionsmodulation. Målet med denne instruktionsprocedure er at demonstrere den trinvise metode til DNA-plasmidelektroporation i museskeletmuskulatur for at lette optagelse og ekspression i myofibrene i tibialis forreste og extensor digitorum longus muskler samt at demonstrere, at skeletmuskelkontraktilitet ikke kompromitteres ved injektion og elektroporation.

Introduction

Plasmid DNA-elektroporation i skeletmuskulatur in vivo er et vigtigt redskab til vurdering af ændringer i skeletmuskelfysiologi og molekylær signalering ved at modulere genekspression i en række fysiologiske og patofysiologiske tilstande 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Eksperimentel genoverførsel til skeletmuskulatur blev demonstreret allerede i 1990 af Wolff et al., hvor både RNA og DNA med succes blev overført uden elektroporation, og luciferaseekspression blev opretholdt i mindst 2 måneder¹⁰. Den relativt lave transfektionseffektivitet kun med injektion er problematisk, og Aihara og Miyazaki demonstrerede øget genoverførsel med elektroporation i 1998 ved at elektroporere en pCAGGS-IL-5-konstruktion i tibialis forreste (TA) muskel og måle serum IL-5-ekspression¹¹. Siden da har mange undersøgelser undersøgt effekten af forskellige DNA-koncentrationer, volumener og elektroporationsparametre for at sikre maksimal genoverførselseffektivitet. Mir et al. testede forskellige elektroporationsparametre, herunder spænding, pulstal, pulsvarighed og frekvens samt DNA-koncentration og fastslog, at større spænding, pulstal og DNA-koncentration alle bidrog til øget elektroporationseffektivitet¹². En stor advarsel mod høj elektroporationsspænding er, at mens det letter øget DNA-optagelse i myofibre, forårsager det også muskelskader, hvilket kan forvirre resultaterne. Schertzer et al. viste, at elektroporation ved 200 V forårsagede skade i omkring 50% af myofibrene 3 dage efter elektroporation, mens kun 10% af myofibrene blev beskadiget ved 50 V¹³. Vi har taget højde for de variabler, der påvirker effektiv DNA-overførsel versus muskelskade og fundet ud af, at en spænding på 125 V pr. Centimeter kaliberbredde er tilstrækkelig til at opnå effektiv genoverførsel.

Analyse af muskelfibertværsnitsareal og hel muskelkontraktilitet efter elektroporation er vigtige aspekter af metoden til måling af ændringer i muskelstørrelse og funktion på grund af genmodulation. Vi og andre har tidligere vist, at elektroporation af kontrolvektorer alene ikke forårsager et fald i myofiberområdet. Konstruktionen af det grønne fluorescerende protein (EGFP) var en nyttig fluorescerende indikator for DNA-transfektion i disse undersøgelser^13,14. En række undersøgelser har undersøgt in situ kontraktilitet af TA efter elektroporation og fundet varierende resultater. En undersøgelse viste, at 75 V / cm elektroporation forårsagede ca. 30% reduktion i tetanisk kraft 3 dage efter elektroporation, og ved 7 dage efter elektroporation var tetanisk kraft tilbage til kontrolniveauet, mens 50 V / cm elektroporation ikke kompromitterede kraft^13,15. En anden undersøgelse viste, at der var et tab på 30% af tetanisk kraft 3 timer efter 180 V / cm elektroporation, som kom sig til de falske kraftniveauer efter 7 dage¹⁶.

I den følgende detaljerede procedure demonstrerer vi injektion og elektroporation af et pcDNA3-EGFP plasmid i TA og extensor digitorum longus (EDL) muskler hos mus. Vi viser også, at denne metode ikke påvirker EDL helmuskelkontraktilitet. Målet er at demonstrere effektiv plasmidoptagelse i myofibre uden at forårsage tab af funktion.

Protocol

Alle forsøg med dyr blev udført på Penn State College of Medicine, godkendt af Penn State University’s Institutional Animal Care and Use Committee og udført i overensstemmelse med de etiske standarder, der er fastsat i Helsinki-erklæringen fra 1964 og dens senere ændringer. 12 uger gamle C57BL/6-hunmus blev anvendt til denne procedure. Alle kirurgiske værktøjer blev autoklaveret for sterilitet inden eksperimentering. 1. Forberedelse af injektion/elektroporation af TA og EDL</stro…

Representative Results

Elektroporation for at lette genoverførsel i skeletmuskulatur er en nyttig teknik, der bruges til at evaluere ændringer i muskelfysiologi. Vi har demonstreret en detaljeret, trin-for-trin procedure for at opnå effektiv genoverførsel i både TA- og EDL-musklerne. Forskelle i transfektionseffektivitet opstår på grund af en række variabler. Blandt disse variabler er elektroporationsparametre (pulser, spænding, pulsvarighed osv.), Genkonstruktionsstørrelse og koncentration / volumen af injiceret DNA. Vi har tidliger…

Discussion

In vivo-genoverførsel i skeletmuskulatur forstærket ved elektroporation er et nyttigt og relativt simpelt værktøj til modulering af proteinekspression i muskler. Vi har vist de trin, der kræves for at opnå effektiv genoverførsel i EDL- og TA-musklerne og demonstreret, at kontraktilitetsmåling af EDL er levedygtig efter proceduren. Denne teknik kræver ikke mere komplicerede virale vektorer og giver mulighed for sammenligning af transinficeret og ikke-transficeret muskelfiber tværsnitsareal i en enkelt m…

Materials

4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section