Elektroporatie van plasmide-DNA in de skeletspieren van de muis
Summary
Elektroporatie van plasmide-DNA in skeletspieren is een haalbare methode om genexpressie te moduleren zonder de spiercontractiliteit bij muizen in gevaar te brengen.
Abstract
Voorbijgaande genexpressiemodulatie in muizenskeletspieren door plasmide-elektroporatie is een nuttig hulpmiddel voor het beoordelen van normale en pathologische fysiologie. Overexpressie of knockdown van doelgenen stelt onderzoekers in staat om individuele moleculaire gebeurtenissen te manipuleren en zo de mechanismen die van invloed zijn op spiermassa, spiermetabolisme en contractiliteit beter te begrijpen. Bovendien stelt elektroporatie van DNA-plasmiden die fluorescerende tags coderen onderzoekers in staat om veranderingen in subcellulaire lokalisatie van eiwitten in skeletspieren in vivo te meten. Een belangrijke functionele beoordeling van de skeletspieren omvat de meting van spiercontractiliteit. In dit protocol tonen we aan dat hele spiercontractiliteitsstudies nog steeds mogelijk zijn na plasmide-DNA-injectie, elektroporatie en genexpressiemodulatie. Het doel van deze instructieprocedure is om de stapsgewijze methode van DNA-plasmide-elektroporatie in de skeletspieren van muizen te demonstreren om de opname en expressie in de myofiberen van de tibialis anterieure en extensor digitorum longusspieren te vergemakkelijken, evenals om aan te tonen dat de contractiliteit van de skeletspier niet wordt aangetast door injectie en elektroporatie.
Introduction
Plasmide DNA-elektroporatie in skeletspieren in vivo is een belangrijk hulpmiddel voor het beoordelen van veranderingen in de skeletspierfysiologie en moleculaire signalering door genexpressie te moduleren in een verscheidenheid aan fysiologische en pathofysiologische omstandigheden 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Experimentele genoverdracht in de skeletspieren werd al in 1990 aangetoond door Wolff et al., waarbij zowel RNA als DNA met succes werden overgedragen zonder elektroporatie, en luciferase-expressie gedurende ten minste 2 maanden werd gehandhaafd10. De relatief lage transfectie-efficiëntie met alleen injectie is problematisch, en Aihara en Miyazaki toonden in 1998 een verhoogde genoverdracht met elektroporatie door een pCAGGS-IL-5-construct in de tibialis anterieure (TA) spier te elektropoderen en serum IL-5 expressie11 te meten. Sinds die tijd hebben veel studies de werkzaamheid van verschillende DNA-concentraties, volumes en elektroporatieparameters onderzocht om maximale genoverdrachtsefficiëntie te garanderen. Mir et al. testten verschillende elektroporatieparameters, waaronder spanning, pulsgetal, pulsduur en frequentie, evenals DNA-concentratie, en stelden vast dat een grotere spanning, pulsgetal en DNA-concentratie allemaal bijdroegen aan een verhoogde elektroporatie-efficiëntie12. Een belangrijk voorbehoud bij een hoge elektroporatiespanning is dat, hoewel het een verhoogde DNA-opname in myofiberen vergemakkelijkt, het ook spierschade veroorzaakt, wat de resultaten kan verstoren. Schertzer et al. toonden aan dat elektroporatie bij 200 V schade veroorzaakte in ongeveer 50% van de myofiberen 3 dagen na elektroporatie, terwijl slechts 10% van de myofiberen beschadigd was bij 50 V13. We hebben rekening gehouden met de variabelen die van invloed zijn op efficiënte DNA-overdracht versus spierschade en ontdekten dat een spanning van 125 V per centimeter remklauwbreedte voldoende is om effectieve genoverdracht te bereiken.
Analyse van het dwarsdoorsnedegebied van spiervezels en de contractiliteit van de hele spier na elektroporatie zijn belangrijke aspecten van de methode voor het meten van veranderingen in spiergrootte en -functie als gevolg van genmodulatie. Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat elektroporatie van controlevectoren alleen geen afname van het myofibergebied veroorzaakt. Het groene fluorescerende eiwit (EGFP) construct was een nuttige fluorescerende indicator van DNA-transfectie in deze studies13,14. Een aantal studies hebben de in situ contractiliteit van de TA na elektroporatie onderzocht en vonden wisselende resultaten. Eén studie toonde aan dat 75 V /cm elektroporatie ongeveer 30% vermindering van de tetanische kracht veroorzaakte 3 dagen na elektroporatie, en 7 dagen na elektroporatie was de tetanische kracht terug op het controleniveau, terwijl 50 V / cm elektroporatie kracht13,15 niet in gevaar bracht. Een andere studie toonde aan dat er een verlies van 30% van tetanische kracht was 3 uur na 180 V / cm elektroporatie, die na 7 dagen herstelde tot de schijnkrachtniveaus16.
In de volgende gedetailleerde procedure demonstreren we injectie en elektroporatie van een pcDNA3-EGFP plasmide in de TA- en extensor digitorum longus (EDL) spieren van muizen. We tonen ook aan dat deze methode geen invloed heeft op de contractiliteit van de hele spieren van EDL. Het doel is om een efficiënte opname van plasmide in myofiberen aan te tonen zonder functieverlies te veroorzaken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo genoverdracht in skeletspieren versterkt door elektroporatie is een nuttig en relatief eenvoudig hulpmiddel voor het moduleren van eiwitexpressie in spieren. We hebben de stappen getoond die nodig zijn om een efficiënte genoverdracht in de EDL- en TA-spieren te bereiken en hebben aangetoond dat contractiliteitsmeting van de EDL levensvatbaar is na de procedure. Deze techniek vereist geen meer gecompliceerde virale vectoren en maakt de vergelijking mogelijk van getransfecteerde en niet-getransfecteerde s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
References
- Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
- Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
- Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
- Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
- Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
- Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
- Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
- Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
- Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
- Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
- Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
- Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
- Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
- Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
- Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
- Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
- Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
- Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
- Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
- Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).
