Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus
Summary
Die Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur ist eine praktikable Methode, um die Genexpression zu modulieren, ohne die Muskelkontraktilität bei Mäusen zu beeinträchtigen.
Abstract
Die transiente Genexpressionsmodulation in der murinen Skelettmuskulatur durch Plasmidelektroporation ist ein nützliches Werkzeug zur Beurteilung der normalen und pathologischen Physiologie. Die Überexpression oder der Knockdown von Zielgenen ermöglicht es den Forschern, einzelne molekulare Ereignisse zu manipulieren und so die Mechanismen, die sich auf die Muskelmasse, den Muskelstoffwechsel und die Kontraktilität auswirken, besser zu verstehen. Darüber hinaus ermöglicht die Elektroporation von DNA-Plasmiden, die für fluoreszierende Tags kodieren, den Forschern, Veränderungen in der subzellulären Lokalisation von Proteinen in der Skelettmuskulatur in vivo zu messen. Eine wichtige funktionelle Beurteilung der Skelettmuskulatur umfasst die Messung der Muskelkontraktilität. In diesem Protokoll zeigen wir, dass nach Plasmid-DNA-Injektion, Elektroporation und Genexpressionsmodulation noch Studien zur Kontraktilität des gesamten Muskels möglich sind. Das Ziel dieses Lehrverfahrens ist es, die Schritt-für-Schritt-Methode der DNA-Plasmid-Elektroporation in die Skelettmuskulatur der Maus zu demonstrieren, um die Aufnahme und Expression in den Myofasern der Musculus tibialis anterior und extensor digitorum longus zu erleichtern und zu zeigen, dass die Kontraktilität der Skelettmuskulatur nicht durch Injektion und Elektroporation beeinträchtigt wird.
Introduction
Die Plasmid-DNA-Elektroporation in die Skelettmuskulatur in vivo ist ein wichtiges Instrument zur Beurteilung von Veränderungen in der Skelettmuskelphysiologie und molekularen Signalgebung durch Modulation der Genexpression unter einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Der experimentelle Gentransfer in die Skelettmuskulatur wurde bereits 1990 von Wolff et al. demonstriert, wobei sowohl RNA als auch DNA erfolgreich ohne Elektroporation übertragen wurden und die Luciferase-Expression für mindestens 2 Monateaufrechterhalten wurde 10. Die relativ geringe Transfektionseffizienz nur bei Injektion ist problematisch, und Aihara und Miyazaki zeigten1998 einen erhöhten Gentransfer mit Elektroporation, indem sie ein pCAGGS-IL-5-Konstrukt in den Tabialis anterior (TA) -Muskel elektropolierten und die IL-5-Expression 11 des Serums maßen. Seitdem haben viele Studien die Wirksamkeit verschiedener DNA-Konzentrationen, -Volumina und -Elektroporationsparameter untersucht, um eine maximale Gentransfereffizienz zu gewährleisten. Mir et al. testeten verschiedene Elektroporationsparameter, einschließlich Spannung, Pulszahl, Pulsdauer und -frequenz sowie DNA-Konzentration, und stellten fest, dass eine höhere Spannung, Pulszahl und DNA-Konzentration zu einer erhöhten Elektroporationseffizienz beitrugen12. Ein Hauptvorbehalt gegen eine hohe Elektroporationsspannung besteht darin, dass sie zwar eine erhöhte DNA-Aufnahme in Myofasern erleichtert, aber auch Muskelschäden verursacht, die die Ergebnisse beeinträchtigen können. Schertzer et al. zeigten, dass die Elektroporation bei 200 V in etwa 50% der Myofasern 3 Tage nach der Elektroporation Schäden verursachte, während nur 10% der Myofasern bei 50 V13 beschädigt wurden. Wir haben die Variablen berücksichtigt, die den effizienten DNA-Transfer im Vergleich zu Muskelschäden beeinflussen, und festgestellt, dass eine Spannung von 125 V pro Zentimeter Bremssattelbreite ausreicht, um einen effektiven Gentransfer zu erreichen.
Die Analyse der Muskelfaserquerschnittsfläche und der gesamten Muskelkontraktilität nach der Elektroporation sind wichtige Aspekte der Methode zur Messung von Veränderungen der Muskelgröße und -funktion aufgrund der Genmodulation. Wir und andere haben bereits gezeigt, dass die Elektroporation von Kontrollvektoren allein keine Abnahme der Myofaserfläche verursacht. Das Konstrukt des grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) war in diesen Studien ein nützlicher fluoreszierender Indikator für die DNA-Transfektion13,14. Eine Reihe von Studien haben die In-situ-Kontraktilität der TA nach der Elektroporation untersucht und unterschiedliche Ergebnisse gefunden. Eine Studie zeigte, dass die 75 V / cm-Elektroporation 3 Tage nach der Elektroporation eine Verringerung der Tetankraft um etwa 30% verursachte, und 7 Tage nach der Elektroporation war die tetanische Kraft wieder auf dem Kontrollniveau, während die 50 V / cm-Elektroporation die Kraft13,15 nicht beeinträchtigte. Eine andere Studie zeigte, dass es einen 30% igen Verlust der Tetankraft 3 h nach 180 V / cm Elektroporation gab, die sich nach 7 Tagen16 auf die Scheinkraftniveaus erholte.
Im folgenden detaillierten Verfahren demonstrieren wir die Injektion und Elektroporation eines pcDNA3-EGFP-Plasmids in den TA- und Extensor digitorum longus (EDL) Muskeln von Mäusen. Wir zeigen auch, dass diese Methode die EDL-Kontraktilität des gesamten Muskels nicht beeinflusst. Ziel ist es, eine effiziente Plasmidaufnahme in Myofasern zu demonstrieren, ohne einen Funktionsverlust zu verursachen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der In-vivo-Gentransfer in der Skelettmuskulatur, der durch Elektroporation verstärkt wird, ist ein nützliches und relativ einfaches Werkzeug zur Modulation der Proteinexpression im Muskel. Wir haben die Schritte gezeigt, die erforderlich sind, um einen effizienten Gentransfer in den EDL- und TA-Muskeln zu erreichen, und gezeigt, dass die Kontraktilitätsmessung der EDL nach dem Verfahren praktikabel ist. Diese Technik erfordert keine komplizierteren viralen Vektoren und ermöglicht den Vergleich von transfizi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
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