माउस कंकाल की मांसपेशी में प्लास्मिड डीएनए का इलेक्ट्रोपोरेशन
Summary
कंकाल की मांसपेशियों में प्लास्मिड डीएनए का इलेक्ट्रोपोरेशन चूहों में मांसपेशियों के संकुचन से समझौता किए बिना जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने का एक व्यवहार्य तरीका है।
Abstract
प्लास्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा म्यूरिन कंकाल की मांसपेशियों में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति मॉडुलन सामान्य और पैथोलॉजिकल फिजियोलॉजी का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। लक्ष्य जीन की ओवरएक्सप्रेशन या नॉकडाउन जांचकर्ताओं को व्यक्तिगत आणविक घटनाओं में हेरफेर करने में सक्षम बनाता है और इस प्रकार, मांसपेशियों, मांसपेशियों के चयापचय और सिकुड़न को प्रभावित करने वाले तंत्र को बेहतर ढंग से समझता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट टैग को एन्कोड करने वाले डीएनए प्लास्मिड का इलेक्ट्रोपोरेशन जांचकर्ताओं को विवो में कंकाल की मांसपेशियों में प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण में परिवर्तन को मापने की अनुमति देता है। कंकाल की मांसपेशियों के एक प्रमुख कार्यात्मक मूल्यांकन में मांसपेशियों की सिकुड़न का माप शामिल है। इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित करते हैं कि प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन, इलेक्ट्रोपोरेशन और जीन अभिव्यक्ति मॉडुलन के बाद पूरे मांसपेशी संकुचन अध्ययन अभी भी संभव हैं। इस अनुदेशात्मक प्रक्रिया का लक्ष्य माउस कंकाल की मांसपेशियों में डीएनए प्लास्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन की चरण-दर-चरण विधि का प्रदर्शन करना है ताकि टिबियलिस पूर्वकाल और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस मांसपेशियों के मायोफाइबर में तेज और अभिव्यक्ति की सुविधा मिल सके, साथ ही यह प्रदर्शित किया जा सके कि कंकाल की मांसपेशी संकुचन इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा समझौता नहीं किया जाता है।
Introduction
विवो में कंकाल की मांसपेशियों में प्लास्मिड डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन विभिन्न प्रकार की शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों में जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करके कंकाल की मांसपेशी शरीर विज्ञान और आणविक सिग्नलिंग में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . कंकाल की मांसपेशियों में प्रायोगिक जीन हस्तांतरण वोल्फ एट अल द्वारा 1990 की शुरुआत में प्रदर्शित किया गया था, जहां आरएनए और डीएनए दोनों को इलेक्ट्रोपोरेशन के बिना सफलतापूर्वक स्थानांतरित किया गया था, और ल्यूसिफेरेज़ अभिव्यक्ति को कम से कम 2 महीने10 तक बनाए रखा गया था। इंजेक्शन के साथ अपेक्षाकृत कम अभिकर्मक दक्षता केवल समस्याग्रस्त है, और ऐहारा और मियाज़ाकी ने 1998 में पीसीएजीजीएस-आईएल -5 निर्माण को टिबियलिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशियों में इलेक्ट्रोपोरेट करके और सीरम आईएल -5 अभिव्यक्ति11 को मापकर इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ जीन हस्तांतरण में वृद्धि का प्रदर्शन किया। उस समय से, कई अध्ययनों ने अधिकतम जीन हस्तांतरण दक्षता सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न डीएनए सांद्रता, वॉल्यूम और इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों की प्रभावकारिता की जांच की है। वोल्टेज, पल्स नंबर, पल्स अवधि और आवृत्ति, साथ ही डीएनए एकाग्रता सहित विभिन्न इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों का परीक्षण किया, और यह निर्धारित किया कि अधिक वोल्टेज, पल्स संख्या और डीएनए एकाग्रता सभी ने इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता में वृद्धि में योगदान दिया12. उच्च इलेक्ट्रोपोरेशन वोल्टेज के लिए एक प्रमुख चेतावनी यह है कि, जबकि यह मायोफाइबर में डीएनए तेज में वृद्धि की सुविधा प्रदान करता है, यह मांसपेशियों को नुकसान भी पहुंचाता है, जो परिणामों को भ्रमित कर सकता है। शर्टज़र एट अल ने दिखाया कि 200 वी पर इलेक्ट्रोपोरेशन ने इलेक्ट्रोपोरेशन के 3 दिनों बाद लगभग 50% मायोफाइबर में नुकसान पहुंचाया, जबकि 50 वी13 पर केवल 10% मायोफाइबर क्षतिग्रस्त हो गए। हमने कुशल डीएनए हस्तांतरण बनाम मांसपेशियों की क्षति को प्रभावित करने वाले चर को ध्यान में रखा है और पाया है कि कैलिपर चौड़ाई के 125 वी प्रति सेंटीमीटर का वोल्टेज प्रभावी जीन हस्तांतरण को पूरा करने के लिए पर्याप्त है।
मांसपेशी फाइबर क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र का विश्लेषण और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद पूरे मांसपेशी संकुचन जीन मॉडुलन के कारण मांसपेशियों के आकार और कार्य में परिवर्तन को मापने के लिए विधि के महत्वपूर्ण पहलू हैं। हमने और अन्य लोगों ने पहले प्रदर्शित किया है कि अकेले नियंत्रण वैक्टर के इलेक्ट्रोपोरेशन से मायोफाइबर क्षेत्र में कमी नहीं होती है। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) निर्माण इन अध्ययनों13,14 में डीएनए अभिकर्मक का एक उपयोगी फ्लोरोसेंट संकेतक था। कई अध्ययनों ने इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद टीए की सीटू सिकुड़न में जांच की है और अलग-अलग परिणाम पाए हैं। एक अध्ययन से पता चला है कि 75 वी / सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन ने इलेक्ट्रोपोरेशन के 3 दिनों के बाद टेटैनिक बल में लगभग 30% की कमी का कारण बना, और 7 दिनों के बाद इलेक्ट्रोपोरेशन तक, टेटैनिक बल नियंत्रण स्तर पर वापस आ गया, जबकि 50 वी / सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन ने बल13,15 से समझौता नहीं किया। एक अन्य अध्ययन से पता चला है कि 180 वी / सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद टेटैनिक बल 3 घंटे का 30% नुकसान हुआ था, जो 7 दिनों16 दिनों के बाद शम बल के स्तर पर ठीक हो गया था।
निम्नलिखित विस्तृत प्रक्रिया में, हम चूहों के टीए और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल) मांसपेशियों में पीसीडीएनए 3-ईजीएफपी प्लास्मिड के इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन का प्रदर्शन करते हैं। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि यह विधि ईडीएल पूरे मांसपेशियों के संकुचन को प्रभावित नहीं करती है। इसका उद्देश्य फ़ंक्शन के नुकसान के बिना मायोफाइबर में कुशल प्लास्मिड अपटेक का प्रदर्शन करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा बढ़ाए गए कंकाल की मांसपेशियों में विवो जीन हस्तांतरण मांसपेशियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए एक उपयोगी और अपेक्षाकृत सरल उपकरण है। हमने ईडीएल और टीए मां…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
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