Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo
Summary
L’elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico è un metodo praticabile per modulare l’espressione genica senza compromettere la contrattilità muscolare nei topi.
Abstract
La modulazione transitoria dell’espressione genica nel muscolo scheletrico murino mediante elettroporazione plasmidica è uno strumento utile per valutare la fisiologia normale e patologica. La sovraespressione o l’abbattimento dei geni bersaglio consente ai ricercatori di manipolare singoli eventi molecolari e, quindi, comprendere meglio i meccanismi che influenzano la massa muscolare, il metabolismo muscolare e la contrattilità. Inoltre, l’elettroporazione dei plasmidi del DNA che codificano i tag fluorescenti consente ai ricercatori di misurare i cambiamenti nella localizzazione subcellulare delle proteine nel muscolo scheletrico in vivo. Una valutazione funzionale chiave del muscolo scheletrico include la misurazione della contrattilità muscolare. In questo protocollo, dimostriamo che gli studi di contrattilità dell’intero muscolo sono ancora possibili dopo l’iniezione di DNA plasmidico, l’elettroporazione e la modulazione dell’espressione genica. L’obiettivo di questa procedura didattica è dimostrare il metodo passo-passo dell’elettroporazione del plasmide del DNA nel muscolo scheletrico del topo per facilitare l’assorbimento e l’espressione nelle miofibre dei muscoli tibiale anteriore ed estensore digitorum longus, nonché dimostrare che la contrattilità del muscolo scheletrico non è compromessa dall’iniezione e dall’elettroporazione.
Introduction
L’elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico in vivo è uno strumento importante per valutare i cambiamenti nella fisiologia del muscolo scheletrico e nella segnalazione molecolare modulando l’espressione genica in una varietà di condizioni fisiologiche e fisiopatologiche 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Il trasferimento genico sperimentale nel muscolo scheletrico è stato dimostrato già nel 1990 da Wolff et al., dove sia l’RNA che il DNA sono stati trasferiti con successo senza elettroporazione e l’espressione della luciferasi è stata mantenuta per almeno 2 mesi10. L’efficienza di trasfezione relativamente bassa con la sola iniezione è problematica, e Aihara e Miyazaki hanno dimostrato un aumento del trasferimento genico con l’elettroporazione nel 1998 elettroporando un costrutto pCAGGS-IL-5 nel muscolo tibiale anteriore (TA) e misurando l’espressione sierica di IL-511. Da quel momento, molti studi hanno studiato l’efficacia di diverse concentrazioni di DNA, volumi e parametri di elettroporazione per garantire la massima efficienza di trasferimento genico. Mir et al. hanno testato diversi parametri di elettroporazione, tra cui tensione, numero di impulsi, durata e frequenza dell’impulso, nonché concentrazione di DNA, e hanno determinato che una maggiore tensione, numero di impulsi e concentrazione di DNA hanno contribuito ad aumentare l’efficienza dell’elettroporazione12. Un avvertimento importante per l’alta tensione di elettroporazione è che, mentre facilita l’aumento dell’assorbimento del DNA nelle miofibre, provoca anche danni muscolari, che possono confondere i risultati. Schertzer et al. hanno dimostrato che l’elettroporazione a 200 V ha causato danni in circa il 50% delle miofibre 3 giorni dopo l’elettroporazione, mentre solo il 10% delle miofibre è stato danneggiato a 50 V13. Abbiamo preso in considerazione le variabili che influenzano il trasferimento efficiente del DNA rispetto al danno muscolare e abbiamo scoperto che una tensione di 125 V per centimetro di larghezza della pinza è sufficiente per realizzare un efficace trasferimento genico.
L’analisi dell’area della sezione trasversale delle fibre muscolari e la contrattilità dell’intero muscolo dopo l’elettroporazione sono aspetti importanti del metodo per misurare i cambiamenti nelle dimensioni e nella funzione muscolare dovuti alla modulazione genica. Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che l’elettroporazione dei vettori di controllo da sola non causa una diminuzione dell’area della miofibra. Il costrutto della proteina fluorescente verde (EGFP) è stato un utile indicatore fluorescente della trasfezione del DNA in questi studi13,14. Numerosi studi hanno studiato la contrattilità in situ del TA dopo elettroporazione e hanno trovato risultati variabili. Uno studio ha dimostrato che l’elettroporazione a 75 V / cm ha causato una riduzione di circa il 30% della forza tetanica 3 giorni dopo l’elettroporazione, e da 7 giorni dopo l’elettroporazione, la forza tetanica è tornata al livello di controllo, mentre l’elettroporazione a 50 V / cm non ha compromesso la forza13,15. Un altro studio ha dimostrato che c’è stata una perdita del 30% di forza tetanica 3 ore dopo 180 V / cm di elettroporazione, che è tornata ai livelli di forza fittizia dopo 7 giorni16.
Nella seguente procedura dettagliata, dimostriamo l’iniezione e l’elettroporazione di un plasmide pcDNA3-EGFP nei muscoli TA ed estensore digitorum longus (EDL) dei topi. Dimostriamo anche che questo metodo non influisce sulla contrattilità del muscolo intero EDL. L’obiettivo è dimostrare un efficace assorbimento del plasmide nelle miofibre senza causare perdita di funzione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il trasferimento genico in vivo nel muscolo scheletrico potenziato dall’elettroporazione è uno strumento utile e relativamente semplice per modulare l’espressione proteica nel muscolo. Abbiamo mostrato i passaggi necessari per ottenere un trasferimento genico efficiente nei muscoli EDL e TA e dimostrato che la misurazione della contrattilità dell’EDL è praticabile seguendo la procedura. Questa tecnica non richiede vettori virali più complicati e consente il confronto trasfettato e non trasfettato dell’area d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
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