マウス骨格筋へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション
Summary
プラスミドDNAの骨格筋へのエレクトロポレーションは、マウスの筋収縮性を損なうことなく遺伝子発現を調節する実行可能な方法である。
Abstract
プラスミドエレクトロポレーションによるマウス骨格筋における一過性遺伝子発現調節は、正常および病理学的生理学を評価するための有用なツールである。標的遺伝子の過剰発現またはノックダウンにより、研究者は個々の分子事象を操作できるため、筋肉量、筋肉代謝、および収縮性に影響を与えるメカニズムをよりよく理解することができます。さらに、蛍光タグをコードするDNAプラスミドのエレクトロポレーションにより、研究者は in vivoで骨格筋におけるタンパク質の細胞内局在の変化を測定することができます。骨格筋の主要な機能評価には、筋肉収縮性の測定が含まれる。このプロトコールでは、プラスミドDNA注入、エレクトロポレーション、および遺伝子発現調節の後も筋肉全体の収縮性研究が依然として可能であることを実証する。この指導手順の目的は、マウス骨格筋へのDNAプラスミドエレクトロポレーションの段階的な方法を実証して、脛骨前筋および伸筋桁長筋の筋線維における取り込みおよび発現を促進し、ならびに骨格筋収縮性が注射およびエレクトロポレーションによって損なわれないことを実証することである。
Introduction
in vivoでの骨格筋へのプラスミドDNAエレクトロポレーションは、様々な生理学的および病態生理学的条件下で遺伝子発現を調節することによって骨格筋生理学および分子シグナル伝達の変化を評価するための重要なツールである1,2,3,4,5,6,7,8,9 .骨格筋への実験的な遺伝子導入は、Wolffらによって1990年に早くも実証され、そこではRNAとDNAの両方がエレクトロポレーションなしで首尾よく転写され、ルシフェラーゼ発現は少なくとも2ヶ月間維持された10。注射のみではトランスフェクション効率が比較的低いことが問題であり、相原と宮崎は1998年にpCAGGS-IL-5構築物を前脛骨(TA)筋にエレクトロポレーションし、血清IL-5発現を測定することによって、エレクトロポレーションによる遺伝子導入の増加を実証した11。それ以来、多くの研究が、遺伝子導入効率を最大化するために、さまざまなDNA濃度、体積、およびエレクトロポレーションパラメータの有効性を調査してきました。Mirらは、電圧、パルス数、パルス持続時間、周波数、DNA濃度を含むさまざまなエレクトロポレーションパラメータを試験し、電圧、パルス数、DNA濃度のすべてがエレクトロポレーション効率の向上に寄与すると判断しました12。高いエレクトロポレーション電圧に対する主な注意点は、筋線維へのDNA取り込みの増加を促進する一方で、筋肉の損傷も引き起こし、結果を混乱させる可能性があることです。Schertzerらは、200Vでのエレクトロポレーションがエレクトロポレーションの3日後にミオファイバーの約50%に損傷を引き起こしたのに対し、50Vで損傷を受けたのはミオファイバーの10%のみであることを示した13。我々は、効率的なDNA移植と筋肉損傷に影響を及ぼす変数を考慮し、ノギス幅1センチメートルあたり125Vの電圧が効果的な遺伝子導入を達成するのに十分であることを見出した。
エレクトロポレーション後の筋線維断面積および筋全体の収縮性の解析は、遺伝子調節による筋の大きさおよび機能の変化を測定するための方法の重要な側面である。我々および他の人々は、制御ベクターのエレクトロポレーションだけではミオファイバー面積の減少を引き起こさないことを以前に実証した。緑色蛍光タンパク質(EGFP)構築物は、これらの研究においてDNAトランスフェクションの有用な蛍光指標であった13、14。多くの研究がエレクトロポレーション後のTAのin situ収縮性を調査し、様々な結果を見出した。ある研究では、75V/cmエレクトロポレーションはエレクトロポレーションの3日後に破傷風力の約30%の減少を引き起こし、エレクトロポレーションの7日後には破傷風力は制御レベルに戻ったが、50V/cmのエレクトロポレーションは力を損なわなかった13,15。別の研究では、180V/cmエレクトロポレーションの3時間後に破傷風力が30%減少し、7日後に偽の力レベルに回復したことを示しました16。
以下の詳細な手順では、我々は、マウスのTAおよび伸筋デジトーラムロンガス(EDL)筋肉におけるpcDNA3-EGFPプラスミドの注入およびエレクトロポレーションを実証する。我々はまた、この方法がEDL全筋収縮性に影響を及ぼさないことを実証する。その目的は、機能喪失を引き起こすことなく筋線維への効率的なプラスミド取り込みを実証することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
エレクトロポレーションによって増強された骨格筋におけるインビボ遺伝子導入は、筋肉におけるタンパク質発現を調節するための有用で比較的単純なツールである。我々は、EDLおよびTA筋肉における効率的な遺伝子導入を達成するために必要なステップを示し、EDLの収縮性測定が手順に従って実行可能であることを実証した。この技術は、より複雑なウイルスベクターを必要とせず?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
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