Elektroporasjon av plasmid DNA i mus skjelettmuskulatur

Summary

Elektroporasjon av plasmid DNA i skjelettmuskulatur er en levedyktig metode for å modulere genuttrykk uten å gå på kompromiss med muskelkontraktilitet hos mus.

Abstract

Forbigående genuttrykksmodulering i murine skjelettmuskulatur ved plasmid elektroporasjon er et nyttig verktøy for å vurdere normal og patologisk fysiologi. Overekspression eller knockdown av målgener gjør det mulig for etterforskere å manipulere individuelle molekylære hendelser og dermed bedre forstå mekanismene som påvirker muskelmasse, muskelmetabolisme og kontraktilitet. I tillegg tillater elektroporasjon av DNA-plasmider som koder fluorescerende tagger undersøkere å måle endringer i subcellulær lokalisering av proteiner i skjelettmuskulatur in vivo. En viktig funksjonell vurdering av skjelettmuskulaturen inkluderer måling av muskelkontraktilitet. I denne protokollen viser vi at hele muskelkontraktilitetsstudier fortsatt er mulig etter plasmid DNA-injeksjon, elektroporasjon og genuttrykksmodulering. Målet med denne instruksjonsprosedyren er å demonstrere trinnvis metode for DNA-plasmid elektroporasjon i mus skjelettmuskulatur for å lette opptak og uttrykk i myofibers av tibialis fremre og ekstensor digitorum longus muskler, samt å demonstrere at skjelettmuskulatur kontraktilitet ikke er kompromittert av injeksjon og elektroporasjon.

Introduction

Plasmid DNA-elektroporasjon i skjelettmuskulatur in vivo er et viktig verktøy for å vurdere endringer i skjelettmuskulaturfysiologi og molekylær signalering ved å modulere genuttrykk i en rekke fysiologiske og patofysiologiske forhold 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Eksperimentell genoverføring til skjelettmuskulatur ble demonstrert så tidlig som i 1990 av Wolff et al., hvor både RNA og DNA ble overført uten elektroporasjon, og luciferaseuttrykk ble opprettholdt i minst 2 måneder¹⁰. Den relativt lave transfeksjonseffektiviteten med injeksjon er bare problematisk, og Aihara og Miyazaki demonstrerte økt genoverføring med elektroporasjon i 1998 ved å elektroporere en pCAGGS-IL-5-konstruksjon i tibialis fremre (TA) muskel og måle serum IL-5 uttrykk¹¹. Siden den gang har mange studier undersøkt effekten av forskjellige DNA-konsentrasjoner, volumer og elektroporasjonsparametere for å sikre maksimal genoverføringseffektivitet. Mir et al. testet forskjellige elektroporasjonsparametere, inkludert spenning, pulsnummer, pulsvarighet og frekvens, samt DNA-konsentrasjon, og fastslo at større spenning, pulsnummer og DNA-konsentrasjon alle bidro til økt elektroporasjonseffektivitet¹². En stor advarsel til høy elektroporasjonsspenning er at selv om det letter økt DNA-opptak i myofibers, forårsaker det også muskelskader, noe som kan forvirre resultatene. Schertzer et al. viste at elektroporasjon ved 200 V forårsaket skade hos rundt 50% av myofibers 3 dager etter elektroporasjon, mens bare 10% av myofibers ble skadet ved 50 V¹³. Vi har tatt hensyn til variablene som påvirker effektiv DNA-overføring kontra muskelskade og funnet ut at en spenning på 125 V per centimeter kaliperbredde er tilstrekkelig til å oppnå effektiv genoverføring.

Analyse av muskelfiber tverrsnittsområde og hele muskelkontraktilitet etter elektroporasjon er viktige aspekter ved metoden for å måle endringer i muskelstørrelse og funksjon på grunn av genmodulering. Vi og andre har tidligere vist at elektroporasjon av kontrollvektorer alene ikke forårsaker en nedgang i myofiberområdet. Den grønne fluorescerende proteinkonstruksjonen (EGFP) var en nyttig fluorescerende indikator på DNA-transfeksjon i disse studiene^13,14. En rekke studier har undersøkt in situ kontraktilitet av TA etter elektroporasjon og funnet varierende resultater. En studie viste at 75 V/cm elektroporasjon forårsaket omtrent 30% reduksjon i tetanisk kraft 3 dager etter elektroporasjon, og med 7 dager etter elektroporasjon var tetanisk kraft tilbake til kontrollnivået, mens 50 V / cm elektroporasjon ikke kompromitterte kraft^13,15. En annen studie viste at det var et 30% tap av tetanisk kraft 3 timer etter 180 V / cm elektroporasjon, som gjenopprettet til sham force-nivåene etter 7 dager¹⁶.

I den følgende detaljerte prosedyren demonstrerer vi injeksjon og elektroporasjon av en pcDNA3-EGFP plasmid i TA og ekstensor digitorum longus (EDL) muskler hos mus. Vi viser også at denne metoden ikke påvirker EDL hele muskel kontraktilitet. Målet er å demonstrere effektivt plasmidopptak i myofibers uten å forårsake tap av funksjon.

Protocol

Alle eksperimenter med dyr ble utført ved Penn State College of Medicine, godkjent av Penn State University’s Institutional Animal Care and Use Committee, og utført i samsvar med de etiske standardene som ble fastsatt i Helsinki-erklæringen fra 1964 og dens senere endringer. 12 uker gamle kvinnelige C57BL/6 mus ble brukt til denne prosedyren. Alle kirurgiske verktøy ble autoklavert for sterilitet før eksperimentering. 1. TA og EDL injeksjon / elektroporasjon forberedelse</p…

Representative Results

Elektroporasjon for å lette genoverføring i skjelettmuskulatur er en nyttig teknikk som brukes til å evaluere endringer i muskelfysiologi. Vi har demonstrert en detaljert, trinnvis prosedyre for å oppnå effektiv genoverføring i både TA- og EDL-musklene. Forskjeller i transfeksjonseffektivitet oppstår på grunn av en rekke variabler. Blant disse variablene er elektroporasjonsparametere (pulser, spenning, pulsvarighet, etc.), genkonstruksjonsstørrelse og konsentrasjon / volum av DNA injisert. Vi har tidligere vist…

Discussion

In vivo genoverføring i skjelettmuskulatur forsterket av elektroporasjon er et nyttig og relativt enkelt verktøy for modulering av proteinuttrykk i muskel. Vi har vist trinnene som kreves for å oppnå effektiv genoverføring i EDL- og TA-musklene og vist at kontraktilitetsmåling av EDL er levedyktig etter prosedyren. Denne teknikken krever ikke mer kompliserte virale vektorer og tillater sammenligning av transfekterte og ikke-transfekterte muskelfiber tverrsnittsområde i en enkelt muskel. En begrensning i d…

Materials

4-0 Nylon suture (non-absorbable)	Ethicon	662G	Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe	Hamilton	80501	microsyringe
C57BLl/6NHsd mice	Envigo	044	12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode	BTX	45-0102	1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis	Aurora Scientific	605A	Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System	BTX	45-0662	electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Scissors for blunt dissection
Force Transducer	Aurora Scientific	407A	To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats	Fine Science Tools	13010-12	Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector	Fisher Scientific	V79020	Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid	Addgene	13031	Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps	Fine Science Tools	11009-13	Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10	Becton Dickinson	37 1210	Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media	VWR	25608-930	Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red	Thermo-Fisher Scientific	W21405	Membrane staining for muscle cross section