Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato
Summary
A eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético é um método viável para modular a expressão genética sem comprometer a contratilidade muscular em camundongos.
Abstract
A modulação da expressão genética transitória no músculo esquelético murino por eletroporação plasmida é uma ferramenta útil para avaliar a fisiologia normal e patológica. A superexpressão ou derrubada de genes-alvo permite aos pesquisadores manipular eventos moleculares individuais e, assim, entender melhor os mecanismos que afetam a massa muscular, o metabolismo muscular e a contralidade. Além disso, a eletroporação de plasmídeos de DNA que codificam etiquetas fluorescentes permite aos pesquisadores medir mudanças na localização subcelular de proteínas no músculo esquelético in vivo. Uma avaliação funcional chave do músculo esquelético inclui a medição da contralução muscular. Neste protocolo, demonstramos que estudos de contratude muscular ainda são possíveis após injeção de DNA plasmid, eletroporação e modulação da expressão genética. O objetivo deste procedimento instrucional é demonstrar o método passo-a-passo da eletroporação plasmóide de DNA no músculo esquelético do camundongo para facilitar a absorção e a expressão nos miofibers dos músculos tibialis anterior e extensor digitorum longus, bem como demonstrar que a contratilação muscular esquelética não está comprometida pela injeção e eletroporação.
Introduction
A eletroporação de DNA plasmídeo no músculo esquelético in vivo é uma ferramenta importante para avaliar alterações na fisiologia muscular esquelética e na sinalização molecular, modulando a expressão genética em uma variedade de condições fisiológicas e fisiofisiológicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . A transferência genética experimental para o músculo esquelético foi demonstrada já em 1990 por Wolff et al., onde tanto o RNA quanto o DNA foram transferidos com sucesso sem eletroporação, e a expressão da luciferase foi mantida por pelo menos 2 mesese 10. A eficiência relativamente baixa de transfecção com injeção é apenas problemática, e Aihara e Miyazaki demonstraram aumento da transferência genética com eletroporação em 1998, eletroporando uma construção pCAGGS-IL-5 no músculo tibialis anterior (TA) e medindo a expressão sérica IL-511. Desde então, muitos estudos têm investigado a eficácia de diferentes concentrações de DNA, volumes e parâmetros de eletroporação para garantir a eficiência máxima da transferência genética. Mir et al. testaram diferentes parâmetros de eletroporação, incluindo tensão, número de pulso, duração do pulso e frequência, bem como concentração de DNA, e determinaram que maior tensão, número de pulso e concentração de DNA contribuíram para o aumento da eficiência da eletroporação12. Uma grande ressalva à alta tensão eletroporação é que, embora facilite o aumento da absorção de DNA em miofibers, também causa danos musculares, o que pode confundir resultados. Schertzer et al. mostraram que a eletroporação a 200 V causou danos em cerca de 50% dos myofibers 3 dias após a eletroporação, enquanto apenas 10% dos myofibers foram danificados em 50 V13. Levamos em consideração as variáveis que afetam a transferência eficiente de DNA versus dano muscular e descobrimos que uma tensão de 125 V por centímetro de largura de pinça é suficiente para realizar uma transferência genética eficaz.
A análise da área transversal da fibra muscular e da contralidade muscular inteira após a eletroporação são aspectos importantes do método para medir mudanças no tamanho e função muscular devido à modulação genética. Nós e outros já demonstramos anteriormente que a eletroporação de vetores de controle por si só não causa uma diminuição na área de miofibra. A construção da proteína fluorescente verde (EGFP) foi um indicador fluorescente útil da transfecção de DNA nestes estudos13,14. Vários estudos investigaram a contração in situ do TA após a eletroporação e encontraram resultados variados. Um estudo mostrou que a eletroporação de 75 V/cm causou uma redução de cerca de 30% na força tetanica 3 dias após a eletroporação, e em 7 dias após a eletroporação, a força tetanica voltou ao nível de controle, enquanto a eletroporação de 50 V/cm não comprometeu a força13,15. Outro estudo mostrou que houve uma perda de 30% da força tetanica 3h após a eletroporação de 180 V/cm, que se recuperou para os níveis de força falsa após 7 dias16.
No procedimento detalhado a seguir, demonstramos injeção e eletroporação de um plasmídeo pcDNA3-EGFP nos músculos TA e extensor digitorum longus (EDL) de camundongos. Também demonstramos que este método não afeta a contratude muscular total edl. O objetivo é demonstrar uma absorção plasmida eficiente em myofibers sem causar perda de função.
Protocol
Representative Results
Discussion
A transferência genética in vivo no músculo esquelético reforçada pela eletroporação é uma ferramenta útil e relativamente simples para modular a expressão proteica no músculo. Mostramos as etapas necessárias para alcançar uma transferência genética eficiente nos músculos EDL e TA e demonstramos que a medição da contratilidade do EDL é viável após o procedimento. Esta técnica não requer vetores virais mais complicados e permite a comparação de fibras transfeinadas e não transfectadas tr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
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