Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы мыши
Summary
Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы является жизнеспособным методом модуляции экспрессии генов без ущерба для сократимости мышц у мышей.
Abstract
Транзиторная модуляция экспрессии генов в мышиных скелетных мышцах путем плазмидной электропорации является полезным инструментом для оценки нормальной и патологической физиологии. Сверхэкспрессия или нокдаун генов-мишеней позволяет исследователям манипулировать отдельными молекулярными событиями и, таким образом, лучше понимать механизмы, которые влияют на мышечную массу, мышечный метаболизм и сократимость. Кроме того, электропорация плазмид ДНК, которые кодируют флуоресцентные метки, позволяет исследователям измерять изменения субклеточной локализации белков в скелетных мышцах in vivo. Ключевая функциональная оценка скелетных мышц включает измерение сократимости мышц. В этом протоколе мы демонстрируем, что исследования сократимости целых мышц все еще возможны после инъекции плазмидной ДНК, электропорации и модуляции экспрессии генов. Целью этой учебной процедуры является демонстрация пошагового метода плазмидной электропорации ДНК в скелетные мышцы мыши для облегчения поглощения и экспрессии в миофибрах передней и разгибательной мышц большеберцовой кости, а также демонстрация того, что сократимость скелетных мышц не нарушается инъекцией и электропорацией.
Introduction
Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы in vivo является важным инструментом для оценки изменений в физиологии скелетных мышц и молекулярной сигнализации путем модуляции экспрессии генов в различных физиологических и патофизиологических условиях 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Экспериментальный перенос генов в скелетные мышцы был продемонстрирован еще в 1990 году Wolff et al., где как РНК, так и ДНК были успешно перенесены без электропорации, а экспрессия люциферазы поддерживалась в течение не менее 2 месяцев10. Относительно низкая эффективность трансфекции только при инъекции проблематична, и Айхара и Миядзаки продемонстрировали повышенный перенос генов с электропорацией в 1998 году путем электропорации конструкции pCAGGS-IL-5 в переднюю мышцу большеберцовой кости (TA) и измерения экспрессии IL-5 сыворотки11. С тех пор во многих исследованиях изучалась эффективность различных концентраций ДНК, объемов и параметров электропорации для обеспечения максимальной эффективности переноса генов. Mir et al. проверили различные параметры электропорации, включая напряжение, число импульсов, продолжительность и частоту импульса, а также концентрацию ДНК, и определили, что большее напряжение, число импульсов и концентрация ДНК способствовали увеличению эффективности электропорации12. Основным предостережением к высокому электропорационному напряжению является то, что, хотя оно способствует увеличению поглощения ДНК миофибрами, оно также вызывает повреждение мышц, что может сбить с толку результаты. Schertzer et al. показали, что электропорация при 200 В вызывала повреждение примерно у 50% миофибров через 3 дня после электропорации, тогда как только 10% миофибров были повреждены при 50 В13. Мы приняли во внимание переменные, влияющие на эффективный перенос ДНК по сравнению с повреждением мышц, и обнаружили, что напряжение 125 В на сантиметр ширины суппорта достаточно для достижения эффективного переноса генов.
Анализ площади поперечного сечения мышечного волокна и сократимости всей мышцы после электропорации является важным аспектом метода измерения изменений размера и функции мышц из-за модуляции генов. Мы и другие ранее продемонстрировали, что электропорация контрольных векторов сама по себе не вызывает уменьшения площади миофибры. Конструкция зеленого флуоресцентного белка (EGFP) была полезным флуоресцентным индикатором трансфекции ДНК в этих исследованиях13,14. Ряд исследований исследовали сократимость ТА in situ после электропорации и обнаружили различные результаты. Одно исследование показало, что электропорация 75 В/см вызвала около 30% снижения тетановой силы через 3 дня после электропорации, а через 7 дней после электропорации тетаническая сила вернулась к контрольному уровню, в то время как электропорация 50 В/см не ставила под угрозу силу13,15. Другое исследование показало, что была 30% потеря тетанической силы через 3 ч после электропорации 180 В / см, которая восстановилась до фиктивных уровней силы через 7 дней16.
В следующей подробной процедуре мы демонстрируем инъекцию и электропорацию плазмиды PCDNA3-EGFP в мышцах ТА и разгибателя digitorum longus (EDL) мышей. Мы также демонстрируем, что этот метод не влияет на сократимость всей мышцы EDL. Цель состоит в том, чтобы продемонстрировать эффективное поглощение плазмид в миофибрах, не вызывая потери функции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Перенос генов in vivo в скелетных мышцах, усиленный электропорацией, является полезным и относительно простым инструментом для модуляции экспрессии белка в мышцах. Мы показали шаги, необходимые для достижения эффективного переноса генов в мышцах EDL и TA, и продемонстрировали, что изме…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Никакой
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
References
- Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
- Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
- Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
- Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
- Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
- Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
- Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
- Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
- Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
- Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
- Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
- Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
- Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
- Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
- Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
- Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
- Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
- Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
- Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
- Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).
