Electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético del ratón
Summary
La electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético es un método viable para modular la expresión génica sin comprometer la contractilidad muscular en ratones.
Abstract
La modulación transitoria de la expresión génica en el músculo esquelético murino por electroporación de plásmidos es una herramienta útil para evaluar la fisiología normal y patológica. La sobreexpresión o derribo de genes diana permite a los investigadores manipular eventos moleculares individuales y, por lo tanto, comprender mejor los mecanismos que afectan la masa muscular, el metabolismo muscular y la contractilidad. Además, la electroporación de plásmidos de ADN que codifican etiquetas fluorescentes permite a los investigadores medir los cambios en la localización subcelular de proteínas en el músculo esquelético in vivo. Una evaluación funcional clave del músculo esquelético incluye la medición de la contractilidad muscular. En este protocolo, demostramos que los estudios de contractilidad muscular completa aún son posibles después de la inyección de ADN plásmido, la electroporación y la modulación de la expresión génica. El objetivo de este procedimiento de instrucción es demostrar el método paso a paso de electroporación de plásmidos de ADN en el músculo esquelético del ratón para facilitar la absorción y expresión en las miofiberes de los músculos tibial anterior y extensor digitorum longus, así como demostrar que la contractilidad del músculo esquelético no se ve comprometida por la inyección y la electroporación.
Introduction
La electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético in vivo es una herramienta importante para evaluar los cambios en la fisiología del músculo esquelético y la señalización molecular mediante la modulación de la expresión génica en una variedad de condiciones fisiológicas y fisiopatológicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . La transferencia experimental de genes al músculo esquelético fue demostrada ya en 1990 por Wolff et al., donde tanto el ARN como el ADN se transfirieron con éxito sin electroporación, y la expresión de luciferasa se mantuvo durante al menos 2 meses10. La eficiencia de transfección relativamente baja con solo inyección es problemática, y Aihara y Miyazaki demostraron una mayor transferencia de genes con electroporación en 1998 al electroporar una construcción de pCAGGS-IL-5 en el músculo tibial anterior (TA) y medir la expresión sérica de IL-511. Desde entonces, muchos estudios han investigado la eficacia de diferentes concentraciones de ADN, volúmenes y parámetros de electroporación para garantizar la máxima eficiencia de transferencia de genes. Mir et al. probaron diferentes parámetros de electroporación, incluyendo voltaje, número de pulso, duración del pulso y frecuencia, así como la concentración de ADN, y determinaron que un mayor voltaje, número de pulso y concentración de ADN contribuyeron a aumentar la eficiencia de la electroporación12. Una advertencia importante para el alto voltaje de electroporación es que, si bien facilita una mayor absorción de ADN en las miofiberes, también causa daño muscular, lo que puede confundir los resultados. Schertzer et al. demostraron que la electroporación a 200 V causó daño en alrededor del 50% de las miofiberes 3 días después de la electroporación, mientras que solo el 10% de las miofiberes se dañaron a 50 V13. Hemos tenido en cuenta las variables que afectan la transferencia eficiente de ADN frente al daño muscular y hemos encontrado que un voltaje de 125 V por centímetro de ancho de pinza es suficiente para lograr una transferencia genética efectiva.
El análisis del área transversal de la fibra muscular y la contractilidad de todo el músculo después de la electroporación son aspectos importantes del método para medir los cambios en el tamaño y la función muscular debido a la modulación génica. Nosotros y otros hemos demostrado previamente que la electroporación de vectores de control por sí sola no causa una disminución en el área de miofibra. El constructo de proteína verde fluorescente (EGFP) fue un indicador fluorescente útil de la transfección de ADN en estos estudios13,14. Varios estudios han investigado la contractilidad in situ de la AT después de la electroporación y han encontrado resultados variables. Un estudio mostró que la electroporación de 75 V / cm causó una reducción de aproximadamente el 30% en la fuerza tetánica 3 días después de la electroporación, y a los 7 días posteriores a la electroporación, la fuerza tetánica volvió al nivel de control, mientras que la electroporación de 50 V / cm no comprometió la fuerza13,15. Otro estudio mostró que hubo una pérdida del 30% de la fuerza tetánica 3 h después de la electroporación de 180 V / cm, que se recuperó a los niveles de fuerza simulada después de 7 días16.
En el siguiente procedimiento detallado, demostramos la inyección y electroporación de un plásmido pcDNA3-EGFP en los músculos TA y extensor digitorum longus (EDL) de ratones. También demostramos que este método no afecta la contractilidad de todo el músculo EDL. El objetivo es demostrar una absorción eficiente de plásmidos en las miofibras sin causar pérdida de función.
Protocol
Representative Results
Discussion
La transferencia de genes in vivo en el músculo esquelético mejorada por electroporación es una herramienta útil y relativamente simple para modular la expresión de proteínas en el músculo. Hemos demostrado los pasos necesarios para lograr una transferencia de genes eficiente en los músculos EDL y TA y hemos demostrado que la medición de la contractilidad del EDL es viable después del procedimiento. Esta técnica no requiere vectores virales más complicados y permite la comparación del área transver…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
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