Elektroporering av plasmid-DNA i musskelettmuskel
Summary
Elektroporering av plasmid-DNA i skelettmuskulaturen är en livskraftig metod för att modulera genuttryck utan att kompromissa med muskelkontraktiliteten hos möss.
Abstract
Övergående genuttrycksmodulering i murin skelettmuskel genom plasmidelektroporering är ett användbart verktyg för att bedöma normal och patologisk fysiologi. Överuttryck eller knockdown av målgener gör det möjligt för utredare att manipulera enskilda molekylära händelser och därmed bättre förstå de mekanismer som påverkar muskelmassa, muskelmetabolism och kontraktilitet. Dessutom tillåter elektroporering av DNA-plasmider som kodar fluorescerande taggar utredare att mäta förändringar i subcellulär lokalisering av proteiner i skelettmuskulaturen in vivo. En viktig funktionell bedömning av skelettmuskulaturen inkluderar mätning av muskelkontraktilitet. I detta protokoll visar vi att hela muskelkontraktilitetsstudier fortfarande är möjliga efter plasmid-DNA-injektion, elektroporering och genuttrycksmodulering. Målet med denna instruktionsprocedur är att demonstrera steg-för-steg-metoden för DNA-plasmidelektroporering i musskelettmuskulatur för att underlätta upptag och uttryck i myofibrerna i tibialis främre och extensor digitorum longus muskler, samt att visa att skelettmuskelkontraktilitet inte äventyras genom injektion och elektroporation.
Introduction
Plasmid-DNA-elektroporering i skelettmuskulaturen in vivo är ett viktigt verktyg för att bedöma förändringar i skelettmuskelfysiologi och molekylär signalering genom att modulera genuttryck i en mängd olika fysiologiska och patofysiologiska tillstånd 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Experimentell genöverföring till skelettmuskulatur demonstrerades redan 1990 av Wolff et al., där både RNA och DNA framgångsrikt överfördes utan elektroporering, och luciferasuttryck bibehölls i minst 2 månader10. Den relativt låga transfektionseffektiviteten med endast injektion är problematisk, och Aihara och Miyazaki visade ökad genöverföring med elektroporering 1998 genom att elektroporera en pCAGGS-IL-5-konstruktion i tibialis främre (TA) muskel och mäta serum IL-5-uttryck11. Sedan dess har många studier undersökt effekten av olika DNA-koncentrationer, volymer och elektroporeringsparametrar för att säkerställa maximal genöverföringseffektivitet. testade olika elektroporeringsparametrar, inklusive spänning, pulsnummer, pulsvaraktighet och frekvens, samt DNA-koncentration, och bestämde att större spänning, pulsnummer och DNA-koncentration alla bidrog till ökad elektroporeringseffektivitet12. En viktig varning för hög elektroporeringsspänning är att även om det underlättar ökat DNA-upptag i myofibrer, orsakar det också muskelskador, vilket kan förvirra resultaten. visade att elektroporering vid 200 V orsakade skador i cirka 50% av myofibrerna 3 dagar efter elektroporering, medan endast 10% av myofibrerna skadades vid 50 V13. Vi har tagit hänsyn till de variabler som påverkar effektiv DNA-överföring kontra muskelskada och funnit att en spänning på 125 V per centimeter bromsokbredd är tillräcklig för att uppnå effektiv genöverföring.
Analys av muskelfibertvärsnittsarea och helmuskelkontraktilitet efter elektroporering är viktiga aspekter av metoden för att mäta förändringar i muskelstorlek och funktion på grund av genmodulering. Vi och andra har tidigare visat att elektroporering av enbart kontrollvektorer inte orsakar en minskning av myofiberområdet. Konstruktionen av grönt fluorescerande protein (EGFP) var en användbar fluorescerande indikator för DNA-transfektion i dessa studier13,14. Ett antal studier har undersökt in situ kontraktilitet av TA efter elektroporering och funnit varierande resultat. En studie visade att 75 V / cm elektroporering orsakade cirka 30% minskning av tetanisk kraft 3 dagar efter elektroporering, och med 7 dagar efter elektroporering var tetanisk kraft tillbaka till kontrollnivån, medan 50 V / cm elektroporering inte äventyrade kraften13,15. En annan studie visade att det fanns en 30% förlust av tetanisk kraft 3 h efter 180 V / cm elektroporering, som återhämtade sig till skenkraftnivåerna efter 7 dagar16.
I följande detaljerade procedur demonstrerar vi injektion och elektroporering av en pcDNA3-EGFP-plasmid i TA- och extensor digitorum longus (EDL) -musklerna hos möss. Vi visar också att denna metod inte påverkar EDL-helmuskelkontraktiliteten. Syftet är att påvisa effektivt plasmidupptag i myofibrer utan att orsaka funktionsförlust.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo genöverföring i skelettmuskulatur förstärkt genom elektroporering är ett användbart och relativt enkelt verktyg för att modulera proteinuttryck i muskler. Vi har visat de steg som krävs för att uppnå effektiv genöverföring i EDL- och TA-musklerna och visat att kontraktilitetsmätning av EDL är livskraftig efter proceduren. Denna teknik kräver inte mer komplicerade virala vektorer och möjliggör jämförelse av transfekterad och icke-transfekt muskelfibertvärsnittsarea i en enda muskel. En…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
References
- Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
- Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
- Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
- Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
- Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
- Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
- Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
- Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
- Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
- Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
- Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
- Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
- Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
- Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
- Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
- Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
- Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
- Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
- Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
- Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).
